[发明专利]一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法

说明书

本发明公开了一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，属于分子细胞遗传学领域，该分子标记是从人类唾液中克隆的一段28S rDNA序列，然后制备成探针(命名为H‑P3K)，与大黄鱼中期染色体杂交，从而获得阳性信号。该探针对大黄鱼染色体作FISH时，可在每条中期染色体的着丝粒及短臂区域上检测到阳性信号，同一条染色体上短臂的信号强度弱于着丝粒信号强度，不同染色体间着丝粒信号强度也存在差异。本发明用于确定着丝粒的位置，分析染色体核型及研究染色体结构；阳性信号可以作为染色体识别和配对的标记。

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学技术领域，涉及一种染色体基因定位方法，具体是一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法。

背景技术

大黄鱼(Larimichthys crocea)俗称“黄花鱼”、“黄瓜鱼”，隶属于鲈形目(Perciformes)，石首鱼科(Scieanidae)，黄鱼属(Larimichthys)，是暖温水性集群洄游鱼类，主要分布在我国黄海南部、东海、台湾海峡以及南海，是我国近海特有鱼种，系四大海洋经济鱼类之一。其育苗养殖规模、从业人员数量等都居海水养殖鱼类之首。大黄鱼有48条染色体，未发现性染色体。染色体长度较短，24对染色体大小依次递减，染色体之间大小差异不显著。所以有关大黄鱼核型公式的报道不一致，甚至臂比也不相同，表明大黄鱼染色体可能存在多态性。

有关大黄鱼染色体核型研究报道仍然较少，且多数报道中的染色图像质量较差；基本停留在传统的核型分析，染色体及片段识别仍然很困难。这一现状已不适合当前快速发展的基因组学和功能基因的研究需要。荧光原位杂交是近20年发展起来的技术，使染色体分析进入分子细胞遗传学水平。rDNA编码序列是真核生物基因组中最保守序列之一，引物可以在较高的分类单元中通用。研究资料表明，rDNA可能在基因组中散播，产生新的rDNA位点、多变的rDNA拷贝，甚至与其它一些多基因家族相联系。rDNA是FISH试验中最常用作探针的序列之一。因此，定位rDNA可以为染色体识别提供标志，也可为研究相关物种的染色体进化提供资料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，用于确定着丝粒的位置，分析染色体核型及研究染色体结构，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种显示大黄鱼着丝粒和短臂的方法，包括以下步骤：

(1)染色体制备

提前20h按每克鱼体重于胸鳍基部注射7.5～8.5mg党参的煎汁液和18～20μg BSA混合液，暂养于24～26℃海水中；提前5h再用同样方法注射同样的试剂；提前2.5h按每克鱼体重于胸鳍基部注射0.4～0.6μg/g的秋水仙素；取头肾细胞，使用0.075M KCl低渗35～45min，卡诺氏固定液固定2～4次，滴片前将卡诺氏固定液换成甲醇/乙酸混合液；在玻片表面呵一层水汽，距玻片1cm处滴加细胞悬浮液，置于空气中自然干燥；

(2)人类基因组DNA提取

用组织基因组DNA提取试剂盒提取人类唾液DNA，在刷牙前，将生理盐水倒入口中，漱口25～35s，吐到废液收集杯，再次将生理盐水倒入口中，用力漱口1min，然后仔细将漱口液吐入一次性口杯中，取1.5ml，室温离心12～18min，离心速度为8000rmp，倒掉上清液，剩余口腔上皮细胞沉淀；

(3)探针制备

根据人类的28S rDNA序列设计引物：18S-UF-5’-GGCACGAGACCGATAGTCAACA-3’18S-UR-5’-ACCTGCTGCGGATATGGGTAC-3’；