[发明专利]地特胰岛素或其类似物的制备方法

说明书

本发明公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，属于胰岛素类似物的制备领域。本发明以B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30蛋白为原料，在未保护desB30蛋白双链N末端α‑氨基的条件下，在pH 8.0‑11的碱性环境下利用活化酯一步选择性地酰化B29位赖氨酸的ε‑氨基，高效生成地特胰岛素或其类似物。本发明对胰岛素前体的酰化反应的pH值、原料比以及酰化时间等参数进行了优化，显著提升了地特胰岛素或其类似物的收率，具有酰化效率高、副产物少、酰化反应时间短、酰化步骤少、工艺简单、生产成本低等优点，为规模化、工业化一步酰化制备地特胰岛素或其类似物提供了一种简捷、高效的方法。

技术领域

本发明涉及胰岛素类似物的制备方法，尤其涉及由人双链胰岛素前体desB30的B29位赖氨酸的ε-氨基选择性酰化生成地特胰岛素或其类似物的方法，属于胰岛素类似物的制备领域。

背景技术

糖尿病是一种由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，其基本病理特征为绝对或相对性胰岛素分泌不足所引起的代谢紊乱。糖尿病已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤后的第三大威胁人类健康的慢性非传染性疾病，尤其是它所带来的视网膜病变、周围神经病变、糖尿病肾病等并发症严重影响了人们的生活质量。

胰岛素及其类似物是最直接和最有效的糖尿病治疗药物，中国胰岛素市场潜力巨大。地特胰岛素(Insulin detemir)是一种中性、可溶的长效胰岛素。它是原型胰岛素去除了B链第30位苏氨酸，通过酰化作用在B29位赖氨酸侧链ε-氨基结合一个14碳的直链脂肪酸而成，是一种胰岛素类似物。酰化的脂肪酸可稳定胰岛素分子的自身聚集，且与白蛋白可逆性结合，使地特胰岛素从皮下注射部位吸收缓慢，作用持续时间延长，在控制血糖的同时能减少低血糖的风险。

由于胰岛素原、胰岛素或胰岛素类似物都具有位于A1、B1位置氨基酸的游离α-氨基与B29位赖氨酸侧链上的游离ε-氨基，这三种游离氨基均可与活性酯、酰卤或酸酐形成共价键，从而形成单酰化胰岛素、双酰化胰岛素甚至三酰化产物。从诺和诺德申请的多项专利中公开的酰化路线，首先利用二碳酸二叔丁酯(BOC)衍生保护胰岛素两条链的N末端α-氨基，再利用肉豆蔻酸琥珀酰亚胺酯酰化B29位赖氨酸的ε-氨基，最后利用TFA脱保护，生成地特胰岛素。如果酰化剂过量会生成大量的二取代或者三取代衍生物，因此该工艺步骤繁琐、副产物多，会增加下游纯化的难度，同时不利于整体收率的提高。ε-氨基选择性酰化专利(中国专利CN1171742A)中采用一步选择性酰化，在pH 10.5的碱性条件下，利用优选活化酯(棕榈酸N-琥珀酰亚胺基酯)进行酰化反应，酸性条件终止反应，该方法虽然在一定程度上提升了酰化效率，其最终的酰化效率仍然不高，距规模化的工业应用尚有一定的距离，有待改进。

现有由胰岛素前体通过酰化反应制备地特胰岛素或其类似物的方法中不同程度的存在酰化效率低、副产物多、成本高等缺点。因此，开发一种新的可产业化的酰化效率高、副产物少，生产成本低的地特胰岛素或其类似物的高效制备方法，将为工业化应用奠定重要的基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，该方法将B链第30位缺少苏氨酸的人双链胰岛素前体desB30，在未保护desB30蛋白双链N末端α-氨基的条件下，利用活化酯一步选择性地酰化B29位赖氨酸的ε-氨基，从而生成地特胰岛素或其类似物。本发明方法的选择性酰化具有效率高、酰化反应时间短、副产物少等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种地特胰岛素或其类似物的制备方法，包括以下步骤：(1)将人双链胰岛素前体desB30溶解于水相缓冲液中，得到desB30前体溶液，调节desB30前体溶液的pH值，然后加入有机相，混匀得到混合溶液；(2)向混合溶液中加入活化酯溶液，进行选择性酰化反应；(3)终止反应，分离纯化，即得；其中，步骤(1)调节desB30前体溶液的pH值至8.0-11.0；优选的，步骤(1)调节desB30前体溶液的pH值至9.0-9.5，更优选为9.0。