[发明专利]发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物及其制备方法和应用。本发明将芘、苝或萘酰胺等发色团与双二异丙基氨基氯化磷相连接得到亚磷中间体，再与DMT保护的脱氧核苷反应，得到发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物。通过DNA的固相合成，将其定点插入到寡聚核苷酸中得到发色团修饰的双链结构稳定的荧光寡聚核苷酸探针。该荧光寡聚核苷酸探针本身没有荧光发射，只有和完全配对的靶链结合后，荧光增强可达23.5倍且响应速度快；对于错配碱基识别明显，几乎没有荧光发射，可以明显区分出单碱基错配，能应用于基因单碱基突变分析和PCR反应过程检测等，在单碱基多态性检测和生化样品中核酸检测等方面中应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及亚磷酰胺单体化合物，尤其涉及磷酸位置发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物，本发明还涉及所述发色团修饰的脱氧核苷亚磷酰胺单体化合物的制备方法及其制备的寡聚核苷酸探针及其在单碱基多态性检测以及目标基因或RNA检测中的应用，属于功能化寡聚核苷酸领域。

背景技术

核酸探针可以与DNA、RNA或蛋白质特异性结合，在化学、生物学和医学研究领域有着广泛的应用，例如核酸纳米粒、生物芯片、mRNA成像、基因筛查和单碱基多态性(SNP)检测等。其中，分子信标(MB)在这些领域应用最为广泛。传统意义上的分子信标是在核酸序列两端分别标记荧光基团和淬灭基团，形成“发卡”状结构，荧光基团与淬灭基团在空间上相互接近，无荧光发射；当和待检测的靶链特异性结合后，“发卡”结构打开，荧光基团与淬灭基团相互远离，发射荧光。碱基组成、碱基错配位置和待分析靶链的长度等都会影响分子信标的选择性和灵敏性。为了进一步优化核酸探针的检测性能，研究者设计了更多结构复杂的分子信标，例如，基于核酸三联体的分子信标，哑铃结构的分子信标，基于核酸四链体结构的分子信标和二元结构的分子信标。这些探针在很大程度上仍然依赖于和靶链整体的碱基互补配对。

为了识别核酸链中碱基配对的局部变化，可以将具有碱基识别作用的核苷定点插入到核酸链的特点位置，从而设计出识别碱基的寡聚核苷酸荧光探针。根据已有的报道，研究者通过以下方式设计了具有荧光效应的核酸碱基：(1)用荧光基团替换掉核苷上的碱基，(2)通过柔性链或刚性链将荧光基团连接在嘧啶碱基的5’位置或嘌呤碱基的7’或8’位置，(3)将荧光基团连接在糖环的不同位置。以上设计在不同程度上可以实现对局部碱基错配的识别，但是除了个别设计识别效果非常明显(对于配对碱基和错配碱基，荧光强度差别可以达到20倍以上)，大多数设计对于错配碱基识别并不明显(荧光强度差别在几倍到十倍的变化)。因此，有必要发展新的修饰策略。

芘是一种重要的稠环芳烃类有机化合物，具有芳香性，有很强的荧光，可以作为染料，在工农业生产和自然科学研究中应用广泛。将芘这一荧光团应用于核酸的化学修饰，引起了众多研究者的兴趣。目前已经报道的芘对寡聚核苷酸的修饰位点主要集中这些地方，具体讲，芘可以通过以下方式连接在寡聚核苷酸上：(1)直接替换掉核苷的碱基；(2)将芘通过柔性链或者刚性链连接在碱基上；(3)连接在糖环骨架上。不同的连接位置和连接位置，对芘修饰的寡聚核苷酸的性质有着不同的影响。

芘功能化的寡聚核苷酸探针在过去的十几年内获得了长足发展，目前在核酸序列检测、碱基多态性识别和核酸高级结构，如G-四连体结构分析等方面获得了一定的应用。目前已有的芘修饰寡聚核苷酸除了个别修饰策略在检测靶标核酸序列和区分单碱基多态性上展现出了优异的性质外，绝大多数修饰策略是不能令人满意的，问题主要集中在以下几个方面：

首先，对靶标核酸序列的检测不够灵敏。例如，糖环骨架的2’位置进行芘修饰，在和完全配对的RNA序列结合前后，荧光强度有20倍以上的增强。但是其他修饰策略，比如碱基上芘荧光团的链接，使得在检测前后只有十倍或者更低的荧光强度变化。这样，在试剂检测中，很容易造成假阳性的检测结果。