[发明专利]一种基于CoFe2O4纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病菌的快速检测方法，尤其涉及一种基于CoFe₂O₄纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法。

背景技术

基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。CoFe₂O₄纳米粒子为抗体修饰改性的CoFe₂O₄纳米粒子，CoFe₂O₄由于具有元素Co,具有高饱和磁化强度，在粒径小到一定程度时，会出现超顺磁特性。因此，其粒子对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大。这也就是这类物质作为造影剂的机理。非常微量的纳米CoFe₂O₄就会造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫时间大幅下降，通过空白对照就能明确，是由于存在这种物质引起的。因此可以构建CoFe2O4纳米粒子生物传感器，从磁共振的角度来做检测。

其主要的原理步骤：（1）检测目标菌的特异性CoFe₂O₄纳米粒子的制备。从市场上购买CoFe₂O₄纳米材料，也可以通过其他化学合成方法制备纳米级的CoFe₂O₄。使用硅烷偶联剂或PEG（聚乙二醇），修饰提高生物相容性，其通式为:Y(CH₂)nSiX₃。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)₃)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。再通过修饰特异性抗体可实现表面功能化，形成特异性粒子，再封闭多余的活性位点。（2）采用常规方法将待检目标菌的特异性单抗固定在酶标板表面，并将多余活性位点封闭，备用。（3）将待检样品加到第（2）步制得的固定了目标菌单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标菌，则目标菌会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。（４）将第（1）步所制的抗体修饰的CoFe₂O₄纳米粒子加入第3）步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标菌，通过粒子的特异性反应，则粒子会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的粒子洗去。在酶标板上剩下的就只有结合目标菌的粒子。若酶标板上没有目标菌，则所以粒子都被洗去。（５）加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了目标菌的粒子洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(CuteNMR，宁波健信公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有粒子存在，从而说明样本中有目标菌，粒子的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明粒子越多，从而间接说明目标菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。

该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。所有的食品标准，致病菌都不得检出。因此，用该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。

发明内容

一种基于CoFe₂O₄纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。

一种基于CoFe₂O₄纳米粒子的NMR食源性致病菌快速检测方法，核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与CoFe₂O₄纳米粒子含量的相关性指标。