[发明专利]一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法

权利要求书

1.一种从人体粪便中分离肠道菌群的方法，其特征在于，它依次包括有以下步骤：

1）无菌采样

采用双层采样袋（1）取样；所述双层采样袋（1）为内、外两层（2、3），其袋体上部设有撕口（4）；所述内层（2）的下部向上折叠，且底端（9）固定在内层（2）的一侧外壁上；所述内层（2）的下部上设有一撕口（4）；

2）拍打均质过滤

将所述双层采样袋（1）上的撕口（4）撕开，弃去外层（3），将内层（2）放入无菌均质过滤袋（7）中，撕开内层（2）下部上的撕口（4），粪便样品直接从撕口（4）形成的通道中进入均质过滤袋（7）；所述均质过滤袋（7）的内部有滤膜夹层（8）；所述滤膜夹层（8）上的滤膜孔孔径大小为 0.1mm～0.45mm；之后加入稀释液，稀释液为无菌水或生理盐水，最后再采用拍打式均质器均质，样品粉碎均质过滤后，制得均质过滤液；

3）离心分离洗涤

将所述均质过滤液用稀释液，于3～8℃下低温离心分离洗涤1～5次，以获取中间菌液层，即得到肠道菌群液；其离心转速7000～15000rpm，每次5～20分钟；

4）过滤

该步骤 4）在离心分离洗涤的操作前后或过程中进行，采用分级过滤器进行；所述分级过滤器中过滤网的孔径从大到小在0.2mm～0.04mm范围内设置；其离心分离洗涤步骤中，同时弃去了离心管中清澈透明，且在显微镜下观察每视野极少细菌的上清液和下层固体杂质，而将呈白色且稀释 10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数的中间层菌层保留。

2.如权利要求1所述从人体粪便中分离肠道菌群的方法，其特征在于：所述滤膜夹层（8）上的滤膜孔孔径大小为0.1～0.25mm。

3.如权利要求 1 所述从人体粪便中分离肠道菌群的方法，其特征在于，它依次包括有以下步骤：

1）无菌采样

采用双层采样袋（1）取样，取样后封口；所述双层采样袋（1）为内、外两层（2、3），其袋体上部设有撕口（4）；所述内层（2）的下部向上折叠，且底端（9）固定在内层（2）的一侧外壁上；所述内层（2）的下部上设有一撕口（4）；

2）无菌加样

将所述双层采样袋（1）上的撕口（4）撕开，弃去外层（3），将内层（2）放入无菌均质过滤袋（7）中，撕开内层（2）下部上的撕口（4），粪便样品直接从撕口（4）形成的通道中进入均质过滤袋（7）；所述均质过滤袋（7）的内部有滤膜夹层（8），袋口处设置有封口条（5）；该滤膜夹层（8）上的滤膜孔孔径大小为0.1mm～0.25mm；

3）加稀释液

加入无菌稀释液，稀释液为无菌水或灭菌的0.9%生理盐水，其加液量为样品重量的2～10倍；

4）拍打均质过滤

采用拍打式均质器均质10秒～600秒，样品粉碎均质过滤后，制得均质过滤液；

5）离心分离洗涤

将所述均质过滤液用无菌稀释液，于3～8℃下低温离心分离洗涤3～4次，以获取中间菌液层，即制得肠道菌群液；其离心转速7000～15000rpm，每次5～ 20分钟；

6）过滤

该步骤 6）在离心分离洗涤的操作前后或过程中进行，采用分级过滤器进行；所述分级过滤器中过滤网的孔径从大到小在0.2mm～0.04mm范围内设置；其离心分离洗涤步骤中，同时弃去了离心管中清澈透明，且在显微镜下观察每视野极少细菌的上清液和下层固体杂质，而将呈白色且稀释10倍后显微镜下观察每视野细菌多至无法计数的中间层菌层保留；

7）无菌分装。

4.如权利要求1-3任一项所述从人体粪便中分离肠道菌群的方法，其特征在于：所述离心分离洗涤的次数为4次。