[发明专利]一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法

权利要求书

1.一种植物组成型油酸表达载体，其特征在于，该表达载体含有SsPDAT1基因，所述SsPDAT1基因是乌桕中促进油脂积累的关键酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的植物组成型油酸表达载体，其特征在于，该表达载体含有35S启动子驱动绿色荧光蛋白基因GFP和SsPDAT1基因形成的融合基因，即35S::GFP-SsPDAT1。

3.根据权利要求1或2所述的植物组成型油酸表达载体，其特征在于，采用的原始连接载体为pEGAD载体。

4.权利要求1或2所述的植物组成型油酸表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以乌桕cDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：

SEQ ID NO：2：5’-CCGGAATTCATGCCTTTAATTCGCCGGAAGAAAC-3’，

SEQ ID NO：3：5’-CGCGGATCCTTACAGCGGCAAGTTGATCTTCTCA-3’；

(2)将步骤(1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用ECOR I和BamHI双酶切pUCm-T载体和pEGAD载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连接；

(3)将步骤(2)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，经抗生素筛选获得阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型油酸表达载体。

5.一种植物组成型油酸表达载体转化油菜的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)通过权利要求1或2所述植物组成型油酸表达载体转化油菜植株；

(2)通过抗性筛选和RT-PCR鉴定得到获得转基因油菜；

(3)通过油脂含量测定验证转化成功。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述转化采用农杆菌介导的转基因方法。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中将所述植物组成型油酸表达载体电击转化农杆菌GV3101，经100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素筛选获得阳性克隆，再进行农杆菌介导的遗传转化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体过程：挑取电击转化的农杆菌单菌落置于20ml含100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养24小时；将菌液按1:100的比例稀释，取200μl稀释菌液涂布新鲜的含100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YEB固体平板，28℃培养2～3天，用150mL的pH5.8的含5％蔗糖、0.05％Silwet-77、0.4％乙酰丁香酮、0.002‰6-BA的1/2MS液体培养基为转化液将培养皿中的农杆菌洗脱下来，配置成OD600-0.8的农杆菌转化菌液；然后将去掉果荚和已开放花朵的油菜花序轻轻伸入塑料袋，让转化菌液充分浸泡花序，时间为30秒；浸泡后的花序立即用羊皮纸袋包扎；2～3天后按上述方法重复转化一次，同一花序共浸泡转化3次；在完成最后一次转化的7天后，摘除花序上的羊皮纸袋；待种子成熟后，收获晒干，得到T0代转基因种子。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：

对T1代幼苗进行Basta抗性筛选，获得的抗性幼苗实行单株收种；

对T2代幼苗继续进行Basta抗性筛选，获得纯合子转基因株系；

采用RT-PCR方法对获得的纯合子转基因株系进行鉴定，获得目的基因SsPDAT1的转基因纯合子株系。

10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，油菜品种为甘蓝型油菜。