[发明专利]一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法

说明书

本发明提供了一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法和转化油菜的方法，利用乌桕的SsPDAT1基因，构建该基因的植物组成型表达载体，并将其转化甘蓝型油菜，通过抗性筛选，RT‑PCR鉴定和油酸含量分析等获得高油酸含量的转基因油菜植株。分析发现，转基因植株的含油量比野生型明显增加。结果表明：通过遗传转化培育出了一个高油酸含量的转基因油菜。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法，和该载体转化油菜的方法。

背景技术

油菜(Brassica napus L.)是植物油和植物蛋白的主要来源之一，占我国油料作物总产量的40％～45％。油菜可分为白菜型油菜(Brassica campestris)、芥菜型油菜(Brassica juncea)和甘蓝型油菜(Brassica napus L.)三大类型：。甘蓝型油菜(Brassicanapus L.，AACC 2n＝38)是由芸薹(AA 2n＝20)和甘蓝(Brassica Olercea，CC 2n＝18)通过自然种间杂交后自然加倍进化而来的一个复合种，我们通常栽培用的就是甘蓝型油菜。

乌桕[Sapium sebiferum(L.)Roxb.]属大戟科乌桕属多年生高大落叶乔木，与油茶、油桐、核桃合称为我国四大木本油料树种。其种子既含油又含脂，乌桕梓油中富含油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸，含量占总脂肪酸的90％左右,单位面积乌桕油脂产量高于油茶、油桐，也高于号称“油王”的油棕。因此，乌桕曾被日本科学家誉为“绿色原子弹”。

PDAT是一种不依赖于酰基CoA的多功能酶，具有底物专一性，以DAG为酰基的受体，将磷脂上的脂酰基转移给sn-1,2-DAG，促进TAG合成。并与真核生物中膜脂成分的变化密切相关，酵母和维管植物的PDAT存在于内质网中。还有一些植物的PDAT定位于叶绿体，在内质网中并未检测到相关的信号肽。除酵母外，在向日葵、蓖麻子等油料作物的微粒体中也克隆到了PDAT基因，但在乌桕中该基因还未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种植物组成型油酸表达载体及其构建方法，该表达载体克隆了乌桕中的油脂积累相关基因PDAT，能够高效表达油酸。

本发明所述的植物组成型油酸表达载体含有SsPDAT1基因，所述SsPDAT1基因是乌桕中促进油脂积累的关键酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。优选该表达载体含有35S启动子驱动绿色荧光蛋白基因GFP和SsPDAT1基因形成的融合基因，即35S::GFP-SsPDAT1。采用的原始连接载体为pEGAD载体。

所述的植物组成型油酸表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)以乌桕cDNA为模板，通过引物进行PCR扩增；其中，所述引物为：

SEQ ID NO：2：5’-CCGGAATTCATGCCTTTAATTCGCCGGAAGAAAC-3’，

SEQ ID NO：3：5’-CGCGGATCCTTACAGCGGCAAGTTGATCTTCTCA-3’；

(2)将步骤(1)中的PCR扩增产物克隆到pUCm-T载体中，经测序鉴定后，用ECOR I和BamH I双酶切pUCm-T载体和pEGAD载体，分别回收小片段和大片段，然后进行连接；

(3)将步骤(2)得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，经抗生素筛选获得阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，得到植物组成型油酸表达载体。

本发明的目的之二是提供上述植物组成型油酸表达载体转化油菜的方法。旨在通过所获得的植物组成型油酸表达载体构建一种油酸含量增加的油菜新品种。

上述目的是通过以下方式实现的。

一种植物组成型油酸表达载体转化油菜的方法，包括以下步骤：