[发明专利]检测中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的基因芯片及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是多位点基因检测芯片，尤其是适用于中枢神经系统真菌性感染者脑脊液中病原菌的快速诊断的集成检测方法。

背景技术

中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)感染是神经系统主要疾病谱之一，临床多表现为脑膜(脑)炎症状，如发热、头痛、呕吐、意识障碍及脑膜刺激征等，病死率和致残率高，早期明确的病原学诊断是临床正确抗感染治疗的关键。真菌性病原体是引起CNS感染的众多病原微生物中较常见之一。长期以来，临床微生物实验室用于诊断真菌性CNS感染病原体的方法主要包括脑脊液涂片镜检与培养鉴定等表型方法、脑脊液免疫学检测方法及基于聚合酶链反应(PCR)的各种技术(如RT-PCR，多重PCR，荧光定量PCR等)，鲜有利用真菌18/28SrRNA基因结构特点构建基因芯片来鉴定病原体的报道。

脑脊液涂片镜检和培养等表型方法目前仍是各临床实验室诊断中枢神经系统感染最常用的检测手段，从中发现致病菌是判断感染的“金标准”，但这些常规方法存在如下不足：(1)由于实验室检测方法学原因导致感染病原体无法检测或检测周期过长，滞后于临床需求使确诊困难而错失早期或关键期的治疗机遇：①脑脊液涂片显微镜检查，检出率低，敏感性差；②脑脊液真菌培养所需时间长(4-7天)、培养阳性率低(约10-15％左右)；③受抗生素使用等因素影响、无法实现广谱病原体的筛查和监测。(2)由于病原体无法或快速准确的分离鉴定，导致治疗的盲目性，使耐药菌增加并加重患者负担：①目前使用的全自动真菌鉴定仪在鉴定某些菌时可能出现差错，鉴定准确性值得商榷；②商品化表型鉴定系统数据库有限，很难区分表型相近病原菌；③质谱鉴定仪鉴定目前仍需先获得阳性菌落，直接检测鉴定真菌病原体仍需大量样本来验证。

脑脊液免疫学检测方法(如隐球菌乳胶凝集检测)只能检测特定病原体，不能检测脑脊液中未知真菌和对病原菌进行分类，存在假阳性率高等缺点。PCR检测方法主要采用荧光定量PCR技术和脱氧核糖核酸测序技术，目前这些技术只能针对单个真菌核酸进行检测，通量低；脱氧核糖核酸测序技术操作复杂，不便于在检验科实验室常规开展，其结果的判定亦存在一定错误的风险，需多拷贝双向测序。而目前众多基因芯片多以硝酸纤维膜和尼龙膜等不同载体和地高辛、胶体金显色等方法制备，虽有基于真菌16SrRNA微型寡合苷酸芯片检测脑脊液病原菌的研究，但存在致病菌覆盖不全面、缺少大样本临床验证数据等不足，鲜有真菌病原体诊断性芯片的报道。

目前临床微生物实验室采用的传统培养鉴定存在诸多客观缺点，如依靠表型鉴定、敏感性低、检测周期长、易受抗生素应用等各方面的限制，鉴定准确性亦值得商榷，不能满足临床快速诊断的要求。目前进行菌种分型的方法主要有聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、测序、序列特异性引物PCR、荧光定量PCR等方法，不仅操作繁琐、检测周期长、通量小，且检测过程影响因素多、不易控制，不能同时对多种病原体进行分型，难以满足临床检验的要求，使临床至今无法开展中枢神经感染真菌病原体的广谱、集成检测。

基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一，其主要原理是将能反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)以一定顺序和密度固定在载体(如载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、塑料片等)上形成阵列，与实际样本(或核酸扩增产物)进行杂交反应，通过杂交信号分析可高通量获得所有待检基因的信息。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为感染病原学诊断提供了一条新的解决途径，对患者感染性疾病的临床治疗、预后评估具有重要作用。

真菌核糖体RNA(rRNA)包括5S、5.8S、18S、28SrRNA，以多拷贝形式存在于所有真核染色体基因中。国内外有利用真菌内转录间隔区(InternalTranscribedSpacer,ITS)基因结构特点用于真菌鉴定的报道。但未见有基于真菌rRNA的芯片技术用于临床检测脑脊液真菌的研究。目前市场上最主要的基因芯片产品是以点样等方法制备的用于基因表达检测的中、低密度基因芯片。基因芯片的一个重要发展趋势是芯片制备、样品处理、杂交、检测以及数据分析的标准化，提高基因芯片的准确性和可靠性。因此，如何即保证检测高通量，又保证芯片性能优越性是其的瓶颈问题之一。而利用基于真菌28SrRNA基因的多位点芯片检测多种中枢神经感染真菌病原体，发挥其操作简单、通量大、结果准确等特点，对于临床分析中枢神经感染真菌病原体及种类具有重要的现实意义。

发明内容