[发明专利]检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒

权利要求书

1.一种检测PD致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：

样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取，取200μl抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：

1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；

2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；

3)12000rpm离心1分钟；

4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；

5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；

6)12000rpm离心2分钟；

7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；

8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；

9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；

10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；

PCR扩增

PCR反应体系：

10×PCRBuffer2.5μl；

HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；

dNTPmix2μl；

上游引物PrimerU1μl；

下游引物PrimerL1μl；

DNA模板xμl；

灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；

PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；

PCR产物纯化

每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，12000rpm离心2min；

柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；

测序反应

反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH₂O；

测序PCR热循环条件：

1)变性的条件，96℃10sec；

2)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；

3)延伸的条件，60℃4min；

4)4℃保温；

每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；

测序产物纯化

10μl反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；

1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；

2)10℃，4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；

3)每管加入100μl70％酒精，离心15min；5℃，3600rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min；

4)室温挥发净酒精，加入10μlHi-DiFormamide溶解DNA；

5)95℃变性5min，4℃保温4min，加样上机；

PCR检测，包括：

1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和样本均采用复孔；

在PD基因突变位点两端设计三对特异性引物；

所述引物GBA-F的核苷酸序列为：

5'-AATTGGGTGCGTAACTTTGTC-3'，

所述引物GBA-R的核苷酸序列为：

5'-ACTTCCCAGACCTCACCATTG-3'，

所述LRRK2-F1引物的核苷酸序列为：

5'-TTGCTAAGCAAAATAGCCCTG-3'，

所述LRRK2-R1引物的核苷酸序列：

5'-AAGATGGTGCTGAGAAGCATTAC-3'；

所述LRRK2-F2引物的核苷酸序列为：

5'-AGATTTTGACAGTGAAAGTGGAAG-3'，

所述LRRK2-R2引物的核苷酸序列：

5'-TAAGGTTTTCTTTACCTGCTTGG-3'

所述引物PCR扩增出目的片段模板；

所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μL，作为检测阴性对照用；

2)25μL反应体系检测：

混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检测；

结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。