[发明专利]检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒

说明书

技术领域

本发明属分子生物学技术领域，涉及检测PD致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒。

背景技术

PD(Parkinson’sdisease)基因，大量研究证明GBA和LRRK2基因突变可能增加患帕金森病的危险性，且在人群中的分布具有明显的种族差异性。GBA基因突变对PD发病潜在影响的研究已成为目前PD研究的热点。中国人群中最常见的GBA基因突变则是L444P，约占36％。LRRK2(富含亮氨酸重复序列激酶2)基因变异不仅能够导致晚发性家族型帕金森病的发生，而且与散发型帕金森病也存在显著相关，为常染色体显性遗传性PD致病基因。其变异具有种族的特异性，在LRRK2基因多态性中，G2385R和R1628P是二个东亚人群的特异性位点，未出现于其他种族。

现有的检测技术主要是基于单个突变位点的PCR和测序方法及单基因芯片方法，缺点主要在于仅仅能检测单个突变位点，不能对多个突变位点进行同时检测，也不能对分布于多个外显子的位点进行同时检测。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种检测PD致病基因突变的方法，其解决了现有技术中进行PD致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种检测PD致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其包括如下实现步骤：

样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取，取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：

1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70℃孵育10分钟；

2)加200μl无水乙醇震荡混合约20秒；

3)12000rpm离心1分钟；

4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；

5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μlHBsolution，室温放置5分钟；

6)12000rpm离心2分钟；

7)加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；

8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μlwashBuffer，12000rpm离心2分钟；

9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min；

10)将收集柱放入一个新的1.5ml离心管内，加入50μl70℃预热的洗脱液,室温放置1-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA；

PCR扩增

PCR反应体系：

10×PCRBuffer2.5μl；

HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；

dNTPmix2μl；

上游引物PrimerU1μl；

下游引物PrimerL1μl；

DNA模板xμl；

灭菌蒸馏水25μl---上述总体积；

PCR产物电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；

PCR产物纯化

每管内加入100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，加入700μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，加入400μlwashingbuffer，12000rpm离心2min；

弃收集管内液体，12000rpm离心2min；

柱内加入30μl70℃预热洗脱液，12000rpm离心3min；

测序反应

反应体系：0.8μlBigDye+1.5μlBigDyeSeqBuffer+3μl引物+1μlPCR纯化产物+3.5μlddH₂O；

测序PCR热循环条件：

1)变性的条件，96℃10sec；

5)退火的条件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25个循环；

6)延伸的条件，60℃4min；

7)4℃保温；

每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；

测序产物纯化

10ul反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；

1)每管加入100μl100％酒精，或每管加入1μl125mMEDTA到管底，或每管加入1μl3MNaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min；