[发明专利]一种金针菇固体转液体的接种方法

权利要求书

1.一种金针菇固体转液体的接种方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

一、试管培养：

(1-1)制作斜面试管：500ml斜面试管培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装13ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

(1-2)接种：将灭菌后的试管趁热摆成斜面，待温度降至室温后开始接种，接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种，每支试管接种面积为3mm×3mm×3mm的正方体菌种块；

(1-3)培养：将接种好的试管放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天，即可用于接种平板培养基；

二、平板培养：

(2-1)制作平板培养基：500ml平板培养基培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装20ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

(2-2)接种：将灭菌后的试管中的培养基趁热倒入平板中，待平板凝固降至室温后开始接种；接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种；将接种针深入培养至7天的母种斜面试管，刮掉斜面表面的气生菌丝，将靠近试管口没有菌丝覆盖的培养基质切开弃除，选取靠近接种点附近布满菌丝的培养基画井字形，以长宽高各3mm均匀切块，然后放入平板培养基中央，封上密封条，一支试管转接6个平板培养基；

(2-3)培养：将接种好的平板放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天左右，即可用于液体三角瓶；

三、接种：

3-1、液体准备：

(3-1-1)配料：每1000ml液体三角瓶培养液所需配料为：白糖20g、豆奶宝3.3g、磷酸二氢钾0.66g、硫酸镁0.66g，称取各种原料进行配料；

(3-1-2)装料：将配好的料装入1000ml的三角瓶中，并充分搅拌溶解，放入一个转子，然后用纯水定容至600ml，且要求PH值在6.2至6.5之间；

(3-1-3)灭菌：将装好料的三角瓶塞上棉塞，并在棉塞外套上锡箔纸，确保锡箔纸完全包裹住棉塞，然后放于高压灭菌锅中，于121℃条件下灭菌60min后取出；

(3-1-4)冷却：将取出的三角瓶在超净台中冷却至18℃至22℃即可准备接种；

3-2、接种培养：

(3-2-1)消毒：将超净台用紫外灯消毒30分钟，且台上的所有工具用酒精和紫外灯消毒后，由专人穿戴专用接种洁净服，戴口罩及医用手套，穿洁净区工作鞋，风淋后进入洁净区，在超净工作台上准备灭菌操作；

(3-2-2)灭菌：将打孔器，接种针所有会深入到平板内的部分通过酒精灯火焰来回灼烧至通红灭菌，然后放置一边冷却；将挑好的平板菌种放入超净台中，并靠近酒精灯火焰附近，撕掉封条，让平板边缘缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫；

(3-2-3)打孔取块：将接种针深入平板培养基，刮掉斜面表面的气生菌丝，再用直径10mm的打孔器沿着菌丝蔓延生长的边缘均匀打孔一圈；盖上平板盖备用；

(3-2-4)接种：将冷却后的液体三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰，并取下锡箔纸和棉塞，快速用接种针分别从平板培养基内选取4颗菌种，放置过程中接种针不要触碰三角瓶内壁；操作完成后分别将棉塞和锡箔纸在火焰上过火后，再把三角瓶塞紧包好；

四、三角瓶液体培养：

(4-1)重复步骤(3-2-2)、(3-2-3)、(3-2-4)操作直至接种结束，每个平板可转接2至3个三角瓶，然后将三角瓶放入摇床中震荡培养，培养温度为20℃，振幅为250r/min；

更换试管时接种针要重新灼烧灭菌，每支母种斜面试管可转接2至3个三角瓶，然后录入菌种批号和接种日期，将三角瓶放入摇床中震荡培养；

培养至第四天取出三角瓶，将液体菌种打碎20s，然后放回继续培养；培养至第9天取出三角瓶，将液体菌种打碎10min，即可用直接用于生产，也可用于液体转固体或液体转发酵罐的扩繁。