[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用

说明书

本发明公开了利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用。本发明的用于植物基因组定点修饰的系统，含有用于植物基因组定点修饰的载体和供体DNA；所述用于植物基因组定点修饰的载体含有Cas9蛋白表达盒、gRNA表达盒和供体DNA；所述gRNA表达盒编码两种gRNA，所述两种gRNA分别靶向于目的植物的靶DNA的两个靶位点；所述靶DNA中待定点修饰片段位于所述两个靶位点之间。利用本发明的系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的技术体系，无脱靶效应，为在水稻和其它作物中利用此系统进行基因的定点修饰提供了依据，为改良其它重要农作物的农艺性状提供基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域中利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是继ZFNs和TALENs技术之后出现的基因组定点编辑新技术。与ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对，可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点；另外CRISPR/Cas9系统可同时对同一基因的不同位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活；此外，CRISPR/Cas9系统操作简单快捷，每次打靶只需替换原有载体上20-30bp的核苷酸序列，更适宜规模化，高通量操作。CRISPR/Cas9作为一种新的靶向基因修饰技术，展现了广阔的发展潜力和应用前景，有望成为未来基因定向编辑的最强有力的工具之一。目前已经应用于水稻、小麦、拟南芥以及本生烟基因组的定点敲除研究中，但尚未有进行重要农作物目标农艺性状通过定点修饰(氨基酸替换或定点整合)进行遗传改良的研究。

利用CRISRP/Cas9系统在作物中对基因组编辑主要分为三种，基因的定点敲除方法获得突变体、对靶标基因的定点修饰及外源基因定点整合。因定点敲除操作方便，技术成熟等特点，在现有报道中最多。Shan等(2013)成功获得水稻OsBADH2、OsPDS基因突变体，突变概率为7.1％-9.4％。Wang等(2013)利用CRISPR技术成功定点敲除小麦TaMLO-A1基因。Miao等(2013)对水稻叶绿素合成基因CAO1和分蘖夹角控制基因LAZY进行编辑，结果表明，有83.3％的T₀代转基因植株中CAO1基因相应位点发生了突变，而有高达91.6％的转基因植株中LAZY基因相应位点发生了突变，其中LAZY基因的突变纯合体的比例达到50％，均表现出分蘖夹角变大的表型。Zhang等(2014)对2个水稻亚种(粳稻日本晴和籼稻Kasalath)11个靶基因中CRISPR/Cas9诱导产生突变的效率、特点、遗传性及特异性等进行分析，T₀代转基因植株突变效率高达66.7％，而且超过一半的靶基因位点在T₀代获得纯合突变体，突变体后代的遗传传递符合经典的孟德尔定律。Ma等(2015)利用CRISPR/Cas9系统共编辑水稻中46个靶位点，突变率平均为85.4％，大部分为均一的双等位突变(54.9％)和纯合突变(24.7％)，并可遗传到后代。以上研究说明，利用CRISPR/Cas9系统可实现对作物特定基因的高效定点突变。