[发明专利]尼罗罗非鱼性别鉴定用引物及PCR鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测鉴定技术，具体的说涉及对尼罗罗非鱼性别进行PCR鉴定的引物及 使用该引物的PCR鉴定方法。

背景技术

尼罗罗非鱼属于鲈形目，丽鱼科，罗非鱼属，原产于约旦的坦噶尼喀湖，我国于1978年 从泰国引进并推广养殖，现在我国已是世界上最大的罗非鱼生产国和出口国。我国主要养殖 的罗非鱼品种有尼罗罗非鱼，奥利亚罗非鱼和奥尼杂交罗非鱼等。由于不同品种的罗非鱼有 很大的形态特征重叠，这使仅从形态上鉴别不同罗非鱼品种非常困难。另外，罗非鱼品种间 很容易杂交，且杂交种可育，杂交种形态又与亲本性状很相似，因此，很容易造成罗非鱼种 质混杂，导致优良经济性状退化，这也是目前制约我国罗非鱼养殖业发展的突出问题。在养 殖过程中雌雄罗非鱼生长差异明显，雄鱼比雌鱼生长快，常常导致出池规格相差悬殊，从而 降低了商品鱼的质量，减少了经济效益。

发明内容

解决的技术问题：为了快速、准确鉴定尼罗罗非鱼性别，防止在养殖过程中因雌雄鱼生 长差异明显导致出池规格相差悬殊，从而降低商品鱼的质量，本发明提供一种尼罗罗非鱼性 别鉴定用引物及PCR鉴定方法。

技术方案：一种尼罗罗非鱼性别PCR鉴定用引物，所述引物能够对尼罗罗非鱼的AMH 基因进行特异性扩增，雄性个体生成2条特异性扩增片段，长度分别为：179bp和412bp，雌 性个体生成1条长度为412bp的特异性扩增片段。

AMH基因是抗缪勒氏管激素基因antiMullerianhormone的缩写，其在Genebank数据库 中的序列号为：EF512167。

优选的，所述尼罗罗非鱼性别PCR鉴定用引物的核苷酸序列为：

正向：5’-CAGGAGGGAGTCAGTTCCGTG-3’

反向：5’-CTCTAGCGGCATCCACACTCC-3’。

一种尼罗罗非鱼性别PCR鉴定方法，该方法以尼罗罗非鱼血液样品中提取的基因组DNA 为模板，采用引物进行PCR扩增，并根据1.5％的琼脂糖凝胶电泳判定结果。

优选的，所述鉴定方法的PCR反应体系为：10×反应MIX液5μL，正反向引物各0.25μL， 浓度为50ng/μL～100ng/μL的DNA模板1μL，用灭菌双蒸水补足至10μL。

优选的，所述鉴定方法的PCR的反应程序为：预变性94℃、2min；94℃变性30s，58℃ 退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。

一种尼罗罗非鱼性别PCR鉴定用试剂盒，包括权利要求1或2所述的引物。

有益效果：(1)使用本发明所述的引物对尼罗罗非鱼的基因组DNA进行扩增，雄性个 体生成2条特异性扩增片段，长度分别为:179bp和412bp，雌性个体生成1条长度为412bp 的特异性扩增片段，能够明显区分，因而可以简单、精确地对尼罗罗非鱼的性别进行鉴定； (2)本发明所述引物特异性强，不会对目标片段以外的其它片段扩增；(3)本发明公开了使 用所述引物的PCR鉴定方法，该方法操作快捷、结果准确，避免了采用传统形态学方法鉴定 不同性别的尼罗罗非鱼带来的结果不稳定的缺陷。

附图说明

图1是纯种尼罗罗非鱼PCR性别鉴定电泳检测结果；

其中，M为DL1000；1-5、11-17为尼罗罗非雄鱼；6-10、18-23为尼罗罗非雌鱼。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明 精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

第1步、引物设计

根据尼罗罗非鱼的AMH基因序列，利用引物设计软件Primer5.0设计引物，引物序列为：

正向：5’-CAGGAGGGAGTCAGTTCCGTG-3’

反向：5’-CTCTAGCGGCATCCACACTCC-3’。

第2步、基因组DNA提取

(1)取待检样品19尾，样品均由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴渔场采得；

(2)尾静脉采血，使用Axygen生产的AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒，并按照说 明书步骤抽提基因组DNA。