[发明专利]用于低频突变检测的二代测序文库的构建方法及试剂盒

说明书

本发明提供一种用于低频突变检测的二代测序文库构建方法及试剂盒。本发明的低频突变检测方法能有效去除假阳性、提高目标DNA片段富集效率且测序数据浪费少。本发明的用于低频突变检测的二代测序文库构建方法包括得到平末端DNA片段、得到3'端加A的DNA片段、使用特定核苷酸序列得到加接头DNA片段以及使用特定核苷酸序列得到扩增产物等步骤。

技术领域

本发明涉及DNA低频突变检测方法、用于DNA低频突变检测的二代测序DNA文库构建方法及试剂盒，属于基因检测领域。

背景技术

基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。在自然状态下，基因发生突变的频率很低，而低频突变是指在DNA样本中突变DNA比例低于1％的突变。例如，目前已经证实孕妇血浆中存在胎儿游离DNA，癌症患者血浆中存在肿瘤特征的游离DNA(能够检测到肿瘤基因突变)，艾滋病、肝炎等患者血浆中存在病毒DNA，即便是癌组织样本(如FFPE)中也存在片段化且比例很低的亚克隆突变。

低频突变DNA在样本中的含量微少，如通过二代测序方法检测DNA低频突变时，这些DNA低频突变往往无法与扩增错误或测序错误相区分，使得检测结果中存在较高的假阳性率。由于血浆游离DNA的片段化利用常规PCR靶向富集效率差，很难通过增加上机数据量，达到极高测序深度，故会浪费大量的测序数据。因此，这种DNA低频突变的检测成为难题。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能有效去除假阳性、提高目标DNA片段富集效率且减少测序数据浪费的DNA低频 突变检测方法、用于DNA低频突变检测的二代测序DNA文库构建方法及试剂盒。

即，本发明包括：

1.一种用于DNA低频突变检测的二代测序DNA文库的构建方法，其包括：

步骤A：将希望进行测序的包含低频DNA的样本中的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；

步骤B：将平末端DNA片段进行3'端加A，得到3'端加A的DNA片段；

步骤C：将所述3'端加A的DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；以及

步骤D：将所述加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物；

其中，所述步骤C中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA的退火产物作为所述接头；

所述步骤D中使用核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA作为PCR扩增引物；且

该方法中仅在所述步骤D中进行一次PCR扩增。

2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤D中还使用核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的单链DNA和核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的单链DNA作为PCR扩增引物。

3.根据项1或2所述的方法，其中，步骤A中的DNA片段的量为1～200ng。

4.根据项1～3中任一项所述的方法，其中，步骤A中的DNA片段的量为5～50ng。

5.根据项1～4中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、所述步骤C与步骤D之间、和/或所述步骤D之后还包括对产物进行纯化的步骤。

6.一种用于构建用于DNA低频突变检测的二代DNA测序文库的试剂盒，其包含：

核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的单链DNA与核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的单链DNA，或者它们的退火产物；以及

核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的单链DNA。