[发明专利]一种酶-菌双联秸秆腐熟剂及其制备方法和使用方法

权利要求书

1.一种酶-菌双联秸秆腐熟剂，其特征在于：由重量比为3-4:1的微生物复合菌剂和复合酶剂混合而成，所述微生物复合菌剂包括绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌，所述绿色木霉菌、黑曲霉、米曲霉、侧孢短芽孢杆菌和酵母融合菌的重量比为1-2:1-2:1-2:2-3:2-3，所述复合酶剂包括发酵里氏木霉产生的纤维素酶、发酵枯草芽孢杆菌产生的半纤维素酶、发酵糙皮侧耳菌产生的木质素酶，所述纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的重量比为1-2:1-2:1-2。

2.一种根据权利要求1所述的酶-菌双联秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A、制备微生物复合菌剂

a、制备绿色木霉菌原粉：将绿色木霉菌孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得绿色木霉菌原粉；

b、制备黑曲霉原粉：将黑曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得黑曲霉原粉；

c、制备米曲霉原粉：将米曲霉孢子粉与面粉按照重量比1:500混匀后接种到培养基上，然后放入无菌发酵室内，温度控制在30℃,发酵时间为35-40小时，发酵完成后进行干燥，水分重量百分比含量控制在10%以下保存备用，制得米曲霉原粉；

d、制备侧孢短芽孢杆菌原粉：将侧孢短芽孢杆菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养18-24小时后再转入三角瓶培养18-24小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养8小时后，开始取样镜检，当芽孢形成率达到90-95％时培养完成；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的侧孢短芽孢杆菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的侧孢短芽孢杆菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；

e、制备酵母融合菌原粉：将酵母融合菌转接到事先准备好的试管斜面上，28-32℃培养24-72小时后再转入三角瓶培养24-72小时，检查确认无杂菌后用作发酵罐接种，发酵罐培养24-72小时后，完成发酵；将发酵液通过离心机进行浓缩，成为浓缩发酵液；将浓缩发酵液打入调配罐内，加入浓缩发酵液重量20-40%的轻质碳酸钙搅拌均匀，然后将其通过喷雾干燥塔进行干燥，保持喷出的酵母融合菌原粉的水分重量百分比含量在5-6％；将喷雾干燥塔塔底和旋风口处的酵母融合菌原粉进行混合，混合均匀后密封保存备用；

f、复合菌剂组配：将制得的绿色木霉菌原粉、黑曲霉原粉、米曲霉原粉、侧孢短芽孢杆菌原粉和酵母融合菌原粉按重量比1-2:1-2:1-2:2-3:2-3进行复合组配，各组份混合均匀得到复合菌剂；

B、制备复合酶剂

a、制备纤维素酶：

（1）种子的活化：将里氏木霉接种到PDA固体培养基上30℃下培养5-6天备用；

（2）液体种子培养：用孢子接种器在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；

（3）发酵罐发酵：将液体种子按5-10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值大于4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为纤维素酶粗酶液；

（4）纤维素酶固体粉末：取纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得纤维素酶固体粉末；

b、制备半纤维素酶：

（1）种子的活化：将4℃冷藏的枯草芽孢杆菌接种到斜面培养基上，37℃恒温培养24h，进行菌种活化；

（2）液体种子培养：在已活化的斜面培养基上挑取一环菌体接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于37℃、120-150rmp震荡培养24h，即为种子液；

（3）发酵罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵罐，发酵罐的装液量为70%，pH为7.5，温度37℃，控制前期通气量为1:0.8，后期通气量为1:1，加入消泡剂，培养48小时后收集发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为半纤维素酶粗酶液；

（4）半纤维素酶固体粉末：取半纤维素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得半纤维素酶固体粉末；

c、制备木质素酶：

（1）种子的活化：将糙皮侧耳菌接种到PDA固体培养基上28℃下培养5-6天；

（2）液体种子培养：在已活化的PDA固体培养基上挑取一环孢子接种于装有液体种子培养基的三角瓶中，于30℃，150r/min摇床上培养2d，作为液体种子；

（3）通气罐发酵：将液体种子按10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵罐的装液量为60%-80%，于28℃培养，控制通气量为0.2-1vvm，转速为120-150r/mim，发酵液pH值为4.0，加入消泡剂，待发酵液粘度明显降低时终止发酵，发酵结束后，发酵液经板框分离，得到发酵液，将发酵液经离心机3500r/min离心10-15min，取上清即为木质素酶粗酶液；

（4）木质素酶固体粉末：取木质素酶粗酶液，向其中加入硫酸钠充分溶解，再经过雾化器雾化成细小的雾滴，然后在干燥塔内干燥，制得木质素酶固体粉末；

d、复合酶剂组配：将上述纤维素酶固体粉末、半纤维素酶固体粉末、木质素酶固体粉末按重量比1-2:1-2:1-2进行混合，制成复合酶剂；

C、腐熟剂组配：将制得的微生物复合菌剂和复合酶剂按重量比3-4:1混合，制成酶-菌双联秸秆腐熟剂。