[发明专利]一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，主要由以下组分组成：

(1)RT-PCR反应液：含有50mMMgSO₄、0.4mMdNTPs；

(2)引物和探针混合液：含扩增H5基因的引物对1、N6基因的特异性引物对2及分别对应的特异性探针；

所述引物对1为扩增H5基因的引物对，其上游引物H5-F为SeqIDNo.1所示序列，下游引物H5-R为SeqIDNo.2所示序列：

SeqIDNo.1：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3；

SeqIDNo.2：5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3；

所述引物对2为扩增N6基因的引物对，其上游引物N6-F为SeqIDNo.3所示序列，下游引物N6-R为SeqIDNo.4所示序列：

SeqIDNo.3：5-GGGTCGARTGCAYAGGATG-3；

SeqIDNo.4：5-TACCACACYACTRCCGATG-3；

所述H5基因对应的探针H5-probe为SeqIDNo.5所示的序列：

SeqIDNo.5：5-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-3；

所述N6基因对应的探针N6-probe为SeqIDNo.6所示的序列：

SeqIDNo.6：5-AAGCACGYCATGCCAYGATG-3；

(3)酶混合液：逆转录酶、Taq酶；

(4)含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品。

2.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述引物对1、2中的H5和N6的上游引物浓度为20μM，H5和N6下游引物浓度均为40μM，H5和N6探针浓度为20μM。

3.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述H5、N6对应的探针5’端含有荧光报告基因，3’端含有荧光猝灭基因，所述荧光报告基团包括：MAR、JUP、URA、NEP、PLU、FAM、HEX、JOE、NED、TET、ROX或CY5；所述荧光猝灭基团包括：TAMRA、BHQ1、BHQ2。

4.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有A型H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，HA片段的DNA浓度为3.6ng/ul，NA片段的DNA浓度为3.3ng/ul。

5.权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述含有H5N6亚型禽流感病毒特异性HA和NA基因片段DNA的阳性标准品，所述的DNA片段可以为质粒、PCR扩增产物或人工合成基因。

6.权利要求1所述A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中反应体系组成为：扩增反应液每管20.0μL，包括RT-PCR反应液16.0μL、H5/N6反应混合液3.0μL、酶混合液1.0μL。

7.一种利用权利要求1所述的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道核酸检测试剂盒进行检测的方法，包括以下步骤：

(1)病毒RNA的提取：取待测样本，提取RNA；

(2)A型H5N6亚型禽流感病毒的实时荧光RT-PCR扩增，利用SeqIDNo.1-6所述针对H5基因和N6基因的扩增引物对和探针，在荧光定量PCR仪中对H5N6亚型禽流感病毒的HA和NA基因进行扩增：

A.在标明编号的PCR反应管中加入扩增反应液16.0μL、引物混合液3.0μL、待检模板5μL和酶混合液1.0μL；

B.将上述PCR反应管混匀离心后置于荧光定量PCR仪内进行以下反应：①50℃保温30分钟，②95℃保温10分钟，③95℃变性15秒，④55℃退火45秒，其中③④循环40次；

(3)结果判读：在仪器正常，阳性标准品和阴性标准品均正常的情况下进行结果分析：

阳性：待测样本检测结果Ct≤35.0，扩增曲线呈S型且有明显指数增长期，判断为H5N6亚型禽流感病毒阳性；

阴性：待测样本检测结果Ct＞38.0，判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性；

可疑：待测样本结果35.0＜Ct＜38.0，重复检测，如果结果一致，判断为H5N6亚型禽流感病毒阳性，如无扩增信号，则判断为H5N6亚型禽流感病毒阴性。