[发明专利]一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒和检测方法。

背景技术

流感病毒是流行性感冒的病原体，属于正粘病毒科，为RNA病毒，根据流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基质1蛋白(Matrixprotein1，M1)抗原性的不同，流感病毒可分为A、B、C三型，其中A型流感病毒是正粘病毒科的唯一属，根据流感病毒表面血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，A型流感病毒可分为18个HA亚型(H1-H18)和11个NA亚型(N1-N11)，H5N1亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)表示一个禽流感病毒具有H5型HA蛋白和N1型NA蛋白。因此，在理论上，根据目前已知的18个HA和11个NA亚型可以组合形成198个亚型流感病毒.人感染A型流感病毒通常局限于3种HA亚型(H1，H2和H3)和2种NA亚型(N1和N2)，而家禽和野生鸟类通常作为其他亚型流感病毒的天然宿主。许多跨物种传播的禽流感病毒已经报道，如H5N1，H5N2，H9N2，H7N7，H7N2，H7N3，H10N7，H7N9和H10N8，尤其是H5N1和H7N9亚型禽流感病毒疫情造成了巨大的经济损失和人感染死亡病例。

2014年2月，一种新型的H5N6亚型重配禽流感病毒造成人类感染，截止2015年7月，全球共报告5例人感染病例，全部病例发生在中国大陆，另外在老挝、越南及中国大陆的禽及禽类市场环境中已检出H5N6亚型禽流感病毒，表明人感染H5N6亚型禽流感疫情形势不容乐观。为了有效地控制人感染H5N6亚型禽流感疫情，早期、快速、特异和敏感的检测方法研究成为当务之急。目前针对H5N6亚型禽流感病毒的检测主要依赖病毒培养、核酸检测和基因测序等方法，其中实时荧光PCR方法因具有快速、特异、敏感的特点，已成为各大研究机构和生物试剂公司优先研究开发的重点方向.

随着分子生物学的快速发展，实时荧光PCR技术在流感分子诊断领域发展最快。2004年JurgenA.Richt等利用real-timeRT-PCR技术进行了北美猪流感病毒的型别和亚型的分子诊断，该体系每次只能进行一个型别或亚型的诊断.2006年multiplexPCR技术被用于呼吸道病毒的分子诊断.2007年有人利用2套multiplexPCR对12种呼吸道病毒进行了分子诊断，但这两种方法都靠凝胶电泳进行结果分析，且自身存在灵敏度差、易交叉污染等不足。2007年real-timePCR被用于同时进行人禽流感病毒H5N1亚型的分子诊断.2008年多重real-timePCR开始被用于常见呼吸道病毒的分子诊断.2009年多管多重荧光定量PCR被用于检测新甲型H1N1流感病毒和季节性流感病毒.2010年单管多重荧光定量PCR开始被用于流感病毒亚型分型.但因为流感病毒的多变性，目前尚没有针对新近发现的A型H5N6流感病毒的单管多重荧光定量PCR试剂盒和诊断方法的报道.

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种快速、特异性强、灵敏度高的A型H5N6亚型禽流感病毒双通道实时荧光PCR检测试剂盒，可用于H5N6亚型禽流感病毒的监测和临床诊断。

本发明所述检测试剂盒具体包括以下组分：

(1)RT-PCR反应液：含有50mMMgSO₄、0.4mMdNTPs；

(2)引物和探针混合液：包含H5及N6特异性引物、探针，其中H5-F和N6-F引物浓度均为20μM，H5-R和N6-R引物浓度均为40μM，H5和N6探针浓度为20μM；扩增特异性引物的序列如下：

H5上游引物H5-F：5-ATTGCTCCAGAATATGCATA-3(SeqIDNo：1)；

H5下游引物H5-R：5-AGARTTTATCGCCCCTATTG-3(SeqIDNo：2)；

H5特异性探针H5-probe：5-荧光报告基团-CAAAATWGTCAAGAAAGGGG-荧光猝灭基团-3(SeqIDNo：5)；

N6上游引物N6-F：5-CTAGGGTCGARTGCATAGGATG-3(SeqIDNo：3)；

N6下游引物N6-R：5-TACCACACYACTGCCGATGC-3(SeqIDNo：4)；

N6特异性探针N6-probe：5-荧光报告基团-AAGCACGTCATGCCAYGATG-荧光猝灭基团-3(SeqIDNo：6)；