[发明专利]Bt蛋白表达系统

说明书

本发明涉及Bt蛋白表达系统，属于生物技术领域。本发明Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac‑C2序列，其启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac‑C2序列如SEQ ID NO：6所示。据此建立的Bt蛋白表达系统，能获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种表达Cry1Ab/Ac融合蛋白的Bt蛋白表达系统。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，转基因水稻主要有抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆环境以及提高水稻品质等多个品种。转cry1Ab/Ac水稻(华恢1号)是华中农业大学自主培育的对二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等具有较强杀虫活性的水稻品种(Field performance oftransgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensisdelta-endotoxin.Tu JM,et al.Nature Biotechnology,2000,18(10):1101-1104)，2009年转Bt抗虫水稻华恢1号和汕优63获得生物安全证书(The first approved transgenicrice in China.Lu C.GM Crops,2010,1(3):113-115)，具有广阔的应用前景。但转基因作物可能会对动物等非靶标生物或生态环境产生一些非预期效应，所以推广转基因作物的前提是要确保其安全性。对转基因植物的评价主要从环境和食用安全性两方面考虑，食品安全性评价包括对营养成份、抗营养因子、毒性、过敏性、抗生素抗性等方面进行全面评估(转基因植物的食品安全性问题及评价策略.许文涛,等.生命科学,2011,23(2):179-185.)。这些安全评价都需要大量的高纯度目标蛋白，但水稻种表达的Cry1Ab/Ac含量极低，又不带有标签，很难纯化。

发明内容

本发明提供一种Bt蛋白表达系统，实现Cry1Ab/Ac融合蛋白在微生物中的高效表达，以获得大量高纯度的Cry1Ab/Ac融合蛋白，为华恢1号等转基因水稻的安全评价及Cry1Ab/Ac蛋白标准物的制备奠定基础。

Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体，其特征在于：载体pHT315插入有mcry1Ab/ac-C2序列，表达载体的启动子为cry1Ac启动子，所述mcry1Ab/ac-C2序列如SEQ ID NO：6所示。

Bt蛋白表达系统，为插入有上述Cry1Ab/Ac融合蛋白表达载体的苏云金芽胞杆菌菌株。

所述苏云金芽胞杆菌菌株为无晶体蛋白的HD73^-菌株。

上述表达载体或表达系统在生产高纯度Cry1Ab/Ac融合蛋白中的应用。

所述应用为采用上述Bt蛋白表达系统表达Cry1Ab/Ac融合蛋白，再经提取和纯化而得到。

所述表达Cry1Ab/Ac融合蛋白为将菌株置于1/2LB固体培养基中，30℃培养。

所述纯化方法为将提取的Cry1Ab/Ac蛋白先经脱盐柱G-25脱盐，再将蛋白样品进行阴离子交换层析，最后再使用脱盐柱G-25进行脱盐。

所述脱盐条件为：柱平衡缓冲液为50mM Na₂CO₃缓冲液，pH 10.5；流速为2mL/min，阴离子交换层析条件为：柱平衡缓冲液为50mM Na₂CO₃缓冲液，pH 10.5；流速为2mL/min，以0-100％的1M NaCl进行梯度洗脱。