[发明专利]一种以黄芪甲苷为配基的免疫亲和层析柱及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以黄芪甲苷为配基的免疫亲和层析柱及其应用。

背景技术

黄芪为常用中药，具有补气固表、敛疮生肌、利尿托毒等功能。现代药理研究表明，黄芪具有增强机体免疫、降血糖、强心、利尿、降压、抗衰老及抗疲劳等多种药理学活性。黄芪中的主要有效成分为黄芪多糖(astragaluspolysaccharides)、黄芪皂苷(astragalussaponins)和黄芪异黄酮(isoflavones)，目前主要采用黄芪皂苷中的黄芪甲苷(AstragalosideIV)作为评价黄芪药材质量优劣的标准。当前黄芪甲苷定量分析的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)、薄层扫描法(TLCS)及荧光法等，虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也不适用于大批量样品的筛选检测。建立一种快速、灵敏、准确、经济的检测黄芪甲苷的免疫学分析方法可以克服上述方法的不足，与其形成优势互补，而建立一种重复性好，灵敏度高，分析结果准确的免疫分析方法最重要的是获得特异性好效价高的抗体。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在黄芪甲苷的检测中起着越来越重要的作用，而抗血清或腹水的成分非常复杂，一些杂蛋白可能会影响抗体与抗原的反应，因此黄芪甲苷抗体的纯化就显得尤为重要。利用亲和层析柱进行靶蛋白的筛选具有效率高，成本低、靶向性好的优点。目前抗体纯化方法主要是盐析法、有机溶剂沉淀法、各种原理的层析法以及亲和纯化法（通常是ProteinA或ProteinG）等，这些都不能得到很纯的特异性抗体，即使是亲和纯化法，也只能得到特异性抗体和非特异性抗体的混合物，而不能将两者分离而得到特异性的抗体，从而影响评价黄芪药材质量优劣的准确性和效率，因此研究一种能够有效分离纯化特异性抗体的纯化方法，具有较高的学术价值和应用前景。是以此为基础建立一种能够快速评价黄芪药材质量优劣的方法，而建立此种方法的前提就是获得效价较高、特异性好的黄芪甲苷单克隆抗体，我们的方法就是通过纯化得到效价高特异性好的黄芪甲苷单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的在于提高黄芪甲苷单克隆抗体的纯化效率，提供“一种以黄芪甲苷为配基的免疫亲和层析柱及其应用”的发明。本发明的主要优点是，1、采用高碘酸钠将黄芪甲苷邻羟基氧化成醛基，可以使黄芪甲苷半抗原与固相载体充分交联；2、利用抗原与抗体的特异性亲和，有效的去除了非特异性抗体及其他杂蛋白，提高黄芪甲苷单克隆抗体的纯化效率，纯度可达99%以上，且操作简单、成本低、污染少。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的，主要的技术方案是，一种以黄芪甲苷为配基的免疫亲和层析柱的制备方法，以黄芪甲苷为配基，具体步骤为：制备黄芪甲苷半抗原，由黄芪甲苷半抗原与固相载体交联制备免疫亲和吸附剂，将免疫亲和吸附剂为填料装入层析柱，用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤填料三次得免疫亲和层析柱。

进一步的技术方案是，所述黄芪甲苷半抗原的制备方法，具体步骤为：

（1）将黄芪甲苷溶于80%甲醇中配成浓度为1mg/mL的黄芪甲苷溶液，即第一溶液；

（2）将NaIO₄溶于蒸馏水中，即第二溶液；

（3）用注射器将第一溶液缓缓滴加至第二溶液中，室温搅拌反应4小时，即第一反应液；

（4）慢慢往第一反应液中滴加乙二醇并室温反应2小时；

（5）终止反应，采用透析袋除去过量NaIO₄，得到黄芪甲苷半抗原。

进一步的技术方案是，所述免疫亲和吸附剂的制备方法，具体步骤为：

（1）将黄芪甲苷半抗原与固相载体置于0.1MpH8.0的碳酸氢钠溶液中，在20-25℃条件下反应4小时，即第二反应液；

其中：黄芪甲苷半抗原/固相载体/0.1MpH8.0的碳酸氢钠溶液配比为：10mg∶2g∶20mL；

（2）将第二反应液用1MpH8.0的乙醇胺水溶液在20-25℃条件下封闭2小时；

（3）封闭交联反应结束，用10mL0.1MpH8.0的碳酸氢钠溶液洗涤交联物去除未结合的黄芪甲苷半抗原，得免疫亲和吸附剂（即填料）。

进一步的技术方案是，所述固相载体为琼脂糖凝胶、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃或聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶中的一种，具体为经环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶6B。

进一步的技术方案是，所述免疫亲和层析柱的制备方法，具体步骤为：