[发明专利]突变酶

说明书

本发明涉及突变酶，特别涉及具有增强性能的突变酶和使用这种酶氧化有机化合物底物的方法。本发明提供一种突变CYP102A1酶，其具有增强的单加氧酶活性和/或改变的产物选择性并且在一个或多个氨基酸残基位置330、191、401、403、307、377、425、276、117、131或215处包括取代。

本申请是申请日为2008年10月8日的题为“突变酶”的中国专利申请No.200880119582.8的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有增强性能的突变酶。

背景技术

生物酶催化剂，如P450_BM-3酶，发现越来越多地用于从精细化学品、中间体、药品和药物代谢物的合成到有机化学污染物和污物的降解的各种工业应用中。蛋白质工程，采用定向进化(directed evolution)或定点突变，可以用于分离已知酶的变异体，这可以对它们的催化活性产生新的契机和应用。

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)(1)的P450_BM-3属于细胞色素P450酶的超家族(或超族，superfamily)。在各种基因序列数据库中存在超过7,700个编码P450酶的基因。P450酶的命名法也已经系统化。酶的超家族称为CYP，之后是酶家族的编号(因此，为CYPl、CYP51、CYP102等)，其被分成通过字母表示的子族(因此，为CYPlA、CYPl0lB等)，并且每一子族成员由数字标识(因此，为CYPlA1、CYP3A4、CYP101D3等)。编码CYP酶的基因由斜体表示，例如CYP101A1基因。P450_BM-3已被标识为CYP102A1，即，它是CYP102家族的第一成员。自此，CYP102A1的系统命名将用于P450_BM-3。

CYP102A1(1)是用于生物转化应用的受关注的酶，因为其是催化上自给自足的。与其他P450酶不一样，其中P450单加氧酶和电子转移辅助因子蛋白是独立的部分(entities)，CYP102A1具有融合至二弗拉芬(diflavin)电子转移还原酶域的血红素单加氧酶域，其在单个多肽中同时含有FAD和FMN辅基。CYP102A1的天然底物被认为是直链或支链的中链脂肪酸(1，2)。CYP102A1血红素域的晶体结构在1993年(3)就可获得，其中揭示了活性位点结构并且存在底物进入通道(或底物接近通道，substrate access channel)。四年之后公布的具有结合底物的晶体结构，指出对于F87一旦底物结合后侧链构象的变化(4)。

对CYP102A1的蛋白质工程已经进行了综述(5～7)。早期的研究集中在活性位点残基F87，其中F87V、F87A、F87Y和F87G突变已经显示出对脂肪酸氧化的活性和选择性具有不同的影响(8～11)。F87上的突变已经发现有利于各种底物的氧化(7)。在底物进入通道入口处的残基如F42、R47和Y51也被标靶。虽然F42A突变降低了酶活性(10)，但是中和或逆转在47位置处的电荷改变了底物的特异性(8，12)，正如疏水性取代Y51A一样。WO0031273公开了突变的R47L/Y51F偶联体(或结合体，couplet)用来促进疏水性有机分子如聚芳香烃和类萜烃的进入、结合和氧化。该偶联体也与F87A、I263A、A264G和M354A突变组合以提供增强的底物氧化的活性和/或产物选择性(13，14)。R47L/Y51F组合，以及在其自身上的R47L和Y51F突变，现在通常用于CYP102A1工程(15～19)。