[发明专利]DC-CIK细胞的制备及其在制备治疗卵巢癌药物中的应用

说明书

本发明提供了一种DC‑CIK细胞的制备及其在制备治疗卵巢癌药物中的应用。该方法为：从卵巢癌病人经血中收集PBMC，在体外运用IL‑2和IFN‑γ诱导后获得DC‑CIK细胞。本发明还提供了DC‑CIK细胞在制备治疗卵巢癌干细胞药物中的应用。通过ELISA检测结果提示，DC‑CIK细胞在体外培养过程中，要比单独培养CIK细胞释放更多的杀伤肿瘤细胞的因子。并且实验结果表明，在同一种细胞浓度比例组合下，DC‑CIK细胞对OCSCs的细胞毒性最强、杀伤效率最高，证明本发明DC‑CIK细胞可以用于制备杀伤卵巢癌干细胞的药物，为治疗卵巢癌提供新的途径，为临床治疗卵巢癌提供新的药物，有较好的应用前景，有较大的社会效益。

技术领域

本发明涉及生物医药，具体涉及DC-CIK(树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞)细胞的制备及其在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer,CIK)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外用多种细胞因子(抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其中CD3+/CD56+细胞是CIK细胞群体中主要的效应细胞，被称为NK样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC(主要组织相容性复合体)限制性杀瘤优点。树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。同时，成熟的DC可以通过II型组织相容性抗原(MHC-II)等途径提呈肿瘤抗原，有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。DC联合CIK(DC-CIK)过继性免疫治疗恶性肿瘤是一种新兴的免疫治疗手段，能有效抑制和杀灭肿瘤细胞且无明显不良反应，降低肿瘤复发及转移风险，提高患者的自身免疫力及生活质量，其安全性得到了广泛认可。已经明确DC-CIK细胞抗肿瘤作用有以下几点：一，CIK细胞可以通过不同的机制识别肿瘤细胞，释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞的裂解，起到直接杀伤肿瘤细胞的作用；二，CIK细胞可以分泌多种细胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞；三，CIK细胞在培养过程中表达FasL(II型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞凋亡；四，DC-CIK可以杀伤多种肿瘤细胞且对于对多重耐药肿瘤细胞同样敏感；五，DC-CIK杀瘤活性不受CsA(环孢霉素A)和FK506(普乐可复)等免疫抑制剂的影响且对正常骨髓造血前体细胞毒性很小(约为25％)。在DC-CIK治疗手段中，DC就像“雷达”，能识别抗原，激活免疫应答。而CIK就像“导弹”，能通过发挥自身细胞毒性，分泌细胞因子，精确杀伤肿瘤细胞。因而，DC-CIK产生了一个高效的免疫系统，经诱导、增殖、活化后，再回输到患者体内，可以显著抑制肿瘤细胞的生长、增殖，帮助机体恢复同肿瘤细胞作斗争的能力，最大限度地调动人体免疫功能，全方位的防止复发和转移，明显改善患者的生活质量，有效延长生存期。

虽然，DC-CIK细胞治疗存在显著的优点，但是，尚无报道DC-CIK细胞治疗手段对肿瘤干细胞的杀伤作用；其次，异体移植DC-CIK细胞仍然存在很大的免疫排斥风险，因此，制约其临床应用。目前DC-CIK细胞来源主要是从患者静脉穿刺途径获得，但反复收集穿刺收集外周血，对于免疫力低下的病人来说，创伤大且容易造成二次感染。目前，已发现人卵巢癌干细胞(Ovarian cancer stem cells,OCSCs)是导致卵巢癌细胞对化疗药物耐受以及产生卵巢癌易于转移、复发和预后不佳的主要原因。然而OCSCs增值侵蚀的深层机制尚不清楚，也没有有效的医疗手段进行抑制。本发明人研究发现卵巢癌病人经血中含有足量的PBMC(单个核细胞)，在体外用运用IL-2和IFN-γ诱导后获得DC-CIK细胞，对肿瘤干细胞具有显著的杀伤作用，因此，宜进行研究。

发明内容