[发明专利]一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法

权利要求书

1.一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)培养花生幼苗：选取生长力旺盛的花生种子，用质量分数为65％-85％的乙醇消毒1-5分钟后用质量分数0.1％的HgCl₂溶液消毒5-15分钟，再用无菌dH₂O冲洗3-4次，置于带有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿加dH₂O20-50mL，花生种子5-15粒，25℃人工气候箱中暗培养20-30h后，设置光照强度1000-2000LX，每天光照培养12-16h，培养72h；

2)胁迫处理与样品采集：花生幼苗培养10-20天后分为两组，其中一组进行通气处理的为对照组，另一组进行低氧胁迫处理20-30h，分别提取对照组与低氧胁迫处理组花生幼苗根的RNA，反转录为cDNA，置于-80--70℃冰箱中保存备用；

3)花生AhGLB序列的应用：对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用荧光定量PCR仪进行定量分析，引物设计如下：

AhGLB-F：5’-TGGAGGCAACAGCATTCACT-3’；

AhGLB-R：5’-ATGCTTCCTTCATGGCTGGT-3’；

Actin-F：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’；

Actin-R：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’；

使用荧光定量PCR仪进行检测，结束后利荧光定量PCR仪自带的SDS2.0版软件进行结果分析；

4)筛选分析。

2.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(1)中乙醇质量分数为75％，乙醇消毒时间为1分钟，HgCl₂溶液消毒时间为8分钟。

3.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(1)中人工气候箱中暗培养时间为24h。

4.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(2)中花生幼苗培养时间为14天，低氧胁迫处理时间为24h。

5.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(2)中cDNA置于-80℃冰箱中保存备用。

6.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(3)中使用荧光定量PCR仪进行检测的具体操作为：第一步预变性：95℃变性2分钟；第二步荧光收集：95℃15秒，58℃15秒，72℃20秒，本步结束时进行荧光信号收集40个循环；第三步融解曲线分析：65℃30秒逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。

7.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(3)中使用的荧光定量PCR仪为Appliedbiosystems7500荧光定量PCR仪。

8.如权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，其特征在于，步骤(4)中筛选分析的具体方法为：将花生的AhGLB基因与内参基因actin进行对比，低氧胁迫处理组的AhGLB基因的表达量明显大于对照组的为耐渍涝品种或植株，表达量与对照组的差异不明显的为不耐渍涝品种或植株。