[发明专利]一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法。

背景技术

水分是植物生长发育过程中重要的生态因子之一，影响植物的生长、发育、代谢和生态地理分布。由水分造成的胁迫一般分为两种，干旱胁迫和渍涝缺氧胁迫，两者对植物生理生态造成的危害非常大。花生是我国主要的油料作物、经济作物和出口创汇作物。花生在生长发育过程中，会受到渍涝缺氧胁迫的危害，从而影响花生的产量与品质。

筛选耐渍涝花生品种是提高渍涝地区花生产量的重要途径之一。研究表明，在渍涝缺氧胁迫下花生的农艺性状会受到影响，花生品种的株高、单株分枝数、单株总果数、单株饱果数等参数都会受到影响而降低；花生在开花期至结荚期受到胁迫时，会导致花生徒长；在生育早期受到水分胁迫时，花生植株的生长发育会受到影响，出现发育迟缓和植株矮小的状况。虽然常规的筛选方法有通过农艺性状数据统计分析，测定不同花生品种在渍涝低氧胁迫条件下的生理生化差异来进行筛选，但存在品种繁多，生长周期长，操作繁琐，成本高，分析处理难等问题。

非共生血红蛋白基因(nsHb)AhGLB能在低氧胁迫时，结合NO作用生成NO3^-，提升NO3^-在植物体中的浓度，满足植物在渍涝缺氧胁迫下对NO3-的需求，同时降低NO对植物造成的伤害，从而减轻渍涝低氧胁迫对植物体的伤害。CN103255147A公开了花生耐渍涝的非共生血红蛋白基因AhGLB及其应用，并公开了不同基因型花生受到不同胁迫处理时该基因特异表达情况，以及筛选出的耐渍涝花生受到渍涝缺氧胁迫处理时该基因的表达情况，但并未公开具体如何使用荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法。

因此，亟需提供一种周期短、操作简便、成本低、分析处理简便的筛选耐渍涝花生品种或植株的方法。

发明内容

本发明提供一种周期短、操作简便、成本低、分析处理简便的筛选耐渍涝花生品种或植株的方法。

本发明为解决上述技术问题所提供的的技术方案是：

一种荧光定量PCR技术筛选耐渍涝花生品种或植株的方法，包括如下步骤：

1)培养花生幼苗：选取生长力旺盛的花生种子，用质量分数为65％-85％的乙醇消毒1-3分钟后用质量分数0.1％的HgCl2溶液消毒5-15分钟，再用无菌dH₂O冲洗3-4次，置于带有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿加dH₂O20-50mL，花生种子5-15粒，25℃人工气候箱中暗培养20-30h后，设置光照强度1000-2000LX，每天光照培养12-16h，培养72h；

2)胁迫处理与样品采集：花生幼苗培养10-20天后分为两组，其中一组进行通气处理的为对照组，另一组进行低氧胁迫处理20-30h，分别提取对照组与低氧胁迫处理组花生幼苗根的RNA，反转录为cDNA，置于-80--70℃冰箱中保存备用；

3)花生AhGLB序列的应用：对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用荧光定量PCR仪进行定量分析，引物设计如下：

AhGLB-F：5’-TGGAGGCAACAGCATTCACT-3’；

AhGLB-R：5’-ATGCTTCCTTCATGGCTGGT-3’；

Actin-F：5’-GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3’；

Actin-R：5’-GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3’；

使用荧光定量PCR仪进行检测，结束后利荧光定量PCR仪自带的SDS2.0版软件进行结果分析；

4)筛选分析。

进一步地，步骤(1)中乙醇质量分数为75％，乙醇消毒时间为1分钟，HgCl₂溶液消毒时间为8分钟。

进一步地，步骤(1)中人工气候箱中暗培养时间为24h。

进一步地，步骤(2)中花生幼苗培养时间为14天，低氧胁迫处理时间为24h。

进一步地，步骤(2)中cDNA置于-80℃冰箱中保存备用。

进一步地，步骤(3)中使用荧光定量PCR仪进行检测的具体操作为：第一步预变性：95℃变性2分钟；第二步荧光收集：95℃15秒，58℃15秒，72℃20秒，本步结束时进行荧光信号收集40个循环；第三步融解曲线分析：65℃30秒逐步升至95℃，每隔0.2℃收集一次荧光。