[发明专利]一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法在审
申请号: | 201510870315.6 | 申请日: | 2015-12-02 |
公开(公告)号: | CN105512513A | 公开(公告)日: | 2016-04-20 |
发明(设计)人: | 曾斌;李疆;田嘉;夏江宏;刘梦雯;李伟阳;刘楠楠 | 申请(专利权)人: | 新疆农业大学 |
主分类号: | G06F19/24 | 分类号: | G06F19/24;C12Q1/68 |
代理公司: | 乌鲁木齐中科新兴专利事务所 65106 | 代理人: | 李静 |
地址: | 830052 新疆维吾*** | 国省代码: | 新疆;65 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 ssr 分子 标记 鉴别 扁桃 植物 种质 方法 | ||
1.一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法,其特征在于按下列步骤进行:
准备扁桃属植物种质材料:
a、早春季,选取健壮、无病虫害的扁桃属植物55份样本的新鲜嫩叶,每份样本以液氮冷 冻后放入温度-70℃超低温冰箱中保存备用;
扁桃属植物种质DNA的提取:
b、迅速加入1000μL,温度65℃预热的含2%十六烷基三甲基溴化铵,1.4M氯化钠,20mM四 乙酸二氨基乙烯,100mM三羟甲基氨基甲烷,pH8.0的缓冲液和8%巯基乙醇的缓冲液,轻轻 摇匀;置于温度65℃水浴锅中温浴60min,其间每隔10min轻轻上下晃动摇匀1次,使溶液 充分裂解;采用台式离心机离心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min,吸取上清液,将 上清液平均分配转入另外两个新的1500μL离心管中,其中每个离心管中均含有480μL上清 液;将每个含有上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1,轻轻上下晃动摇匀,离 心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min,吸取上清液,将每个离心管中的上清液合并, 转入另一个新的1500μL离心管中,离心管中含有600μL上清液;将装有600μL上清液的离心 管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1,轻轻上下晃动摇匀,离心,温度21℃,转速10000r/ min,时间15min,再吸取上清液,将上清液转入另一个新的1500μL离心管中,离心管中含有 400μL上清液;将装有400μL上清液的离心管中加入2倍体积的冷冻无水乙醇,放入温度-20 ℃冷冻冰箱,时间30min,离心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min后有清晰乳白色的 DNA白絮沉淀,去除上部液体;再将乳白色的DNA白絮沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤2-3次, 自然风干后,溶于50μL含有10mM三羟甲基氨基甲烷,1mM四乙酸二氨基乙烯,pH8.0的缓冲 溶液中,温度-20℃冰箱保存;
c、用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将步骤b得到的DNA浓度稀释至50ng/μl后, 置于温度-20℃冰箱中备用;
d、SSR引物筛选:
根据NCBI数据库上搜索,从来源于核果类果树作物的100对SSR引物中通过初筛和复 筛,最终选出10对产物主带明显并且多态性较好的引物进行SSR微卫星分子标记分析,其中 SSR10对标记为:
标记1BPPCT002,其上游引物5’TCGACAGCTTGATCTTGACC,下游引物5’CAATGCCTACGGAGATAAAAGAC;
标记2BPPCT004,其上游引物5’CTGAGTGATCCATTTGCAGG,下游引物5’AGGGCATCTAGACCTCATTGTT;
标记3BPPCT032,其上游引物5’TTAAGCCACAACATCCATGAT,下游引物5’AATGGTCTAAGGAGCACACG;
标记4BPPCT036,其上游引物5’AAGCAAAGTCCATAAAAACGC,下游引物5’GGACGAAGACGCTCCATT;
标记5BPPCT040,其上游引物5’ATGAGGACGTGTCTGAATGG,下游引物5’AGCCAA ACCCCTCTTATACG;
标记6Pchgms1,其上游引物5’GGGTAAATATGCCCATTGTGCAATC,下游引物5’GGATCATTGAACTACGTCAATCCTC;
标记7Pchgms3,其上游引物5’ACGGTATGTCCGTACACTCTCCATG,下游引物5’CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC;
标记8Pchgms10,其上游引物5’CGTCACGCATCCTTTCATTT,下游引物5’GACACCTCCATTTGTATCAAAGC;
标记9Pchgms11,其上游引物5’TTGAGGCCCACTTATTAGCC,下游引物5’CCCCCATTATTCAAACTTCTG;
标记10Pchgms21,其上游引物5’ACCACCATTTTGGCTCTCTG,下游引物5’CATGCAACCCAAAACCATCT;
e、SSR一PCR扩增反应、电泳检测:SSR-PCR反应体系20μl反应体系包含:10×Taq酶配 套缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPS,SSR上下游引物各为0.2mol/μl,0.5U TaqDNA聚合酶,DNA模板30ng,相应的扩增程序为:温度94℃预变性,4min,然后是温度 94℃变性60s,温度55℃复性40s,温度72℃延伸60s,共34个循环后,温度72℃延伸8 min补齐,扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer2.0μl,取2.5μl上样,用8%非变性聚丙烯酞 胺凝胶电泳检测,银染显色;
f、统计分析:基于不加权配对组算术方法的聚类分析用NTSYS-pc2.10e软件进行数据 分析,选择清晰可辨的电泳带,样品有带则记为1,无带则记为0,构建二态数据矩阵;对原始 矩阵用SimQual程序求SSM相似系数及遗传距离矩阵,并用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类 分析,基于Wagner简约法的聚类分析用PHYLIP3.65软件包中SEQBOOT、MIX、CONSENSE等程序 作出一致性树图,并用TreeView1.6程序生成简约图,构建分子进化系统树。
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