[发明专利]一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法在审

专利信息
申请号: 201510870315.6 申请日: 2015-12-02
公开(公告)号: CN105512513A 公开(公告)日: 2016-04-20
发明(设计)人: 曾斌;李疆;田嘉;夏江宏;刘梦雯;李伟阳;刘楠楠 申请(专利权)人: 新疆农业大学
主分类号: G06F19/24 分类号: G06F19/24;C12Q1/68
代理公司: 乌鲁木齐中科新兴专利事务所 65106 代理人: 李静
地址: 830052 新疆维吾*** 国省代码: 新疆;65
权利要求书: 查看更多 说明书: 查看更多
摘要:
搜索关键词: 一种 基于 ssr 分子 标记 鉴别 扁桃 植物 种质 方法
【权利要求书】:

1.一种基于SSR分子标记鉴别扁桃属植物种质的方法,其特征在于按下列步骤进行:

准备扁桃属植物种质材料:

a、早春季,选取健壮、无病虫害的扁桃属植物55份样本的新鲜嫩叶,每份样本以液氮冷 冻后放入温度-70℃超低温冰箱中保存备用;

扁桃属植物种质DNA的提取:

b、迅速加入1000μL,温度65℃预热的含2%十六烷基三甲基溴化铵,1.4M氯化钠,20mM四 乙酸二氨基乙烯,100mM三羟甲基氨基甲烷,pH8.0的缓冲液和8%巯基乙醇的缓冲液,轻轻 摇匀;置于温度65℃水浴锅中温浴60min,其间每隔10min轻轻上下晃动摇匀1次,使溶液 充分裂解;采用台式离心机离心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min,吸取上清液,将 上清液平均分配转入另外两个新的1500μL离心管中,其中每个离心管中均含有480μL上清 液;将每个含有上清液的离心管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1,轻轻上下晃动摇匀,离 心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min,吸取上清液,将每个离心管中的上清液合并, 转入另一个新的1500μL离心管中,离心管中含有600μL上清液;将装有600μL上清液的离心 管中加入等体积的氯仿:异戊醇=24:1,轻轻上下晃动摇匀,离心,温度21℃,转速10000r/ min,时间15min,再吸取上清液,将上清液转入另一个新的1500μL离心管中,离心管中含有 400μL上清液;将装有400μL上清液的离心管中加入2倍体积的冷冻无水乙醇,放入温度-20 ℃冷冻冰箱,时间30min,离心,温度21℃,转速10000r/min,时间15min后有清晰乳白色的 DNA白絮沉淀,去除上部液体;再将乳白色的DNA白絮沉淀用浓度为70%的乙醇洗涤2-3次, 自然风干后,溶于50μL含有10mM三羟甲基氨基甲烷,1mM四乙酸二氨基乙烯,pH8.0的缓冲 溶液中,温度-20℃冰箱保存;

c、用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度;将步骤b得到的DNA浓度稀释至50ng/μl后, 置于温度-20℃冰箱中备用;

d、SSR引物筛选:

根据NCBI数据库上搜索,从来源于核果类果树作物的100对SSR引物中通过初筛和复 筛,最终选出10对产物主带明显并且多态性较好的引物进行SSR微卫星分子标记分析,其中 SSR10对标记为:

标记1BPPCT002,其上游引物5TCGACAGCTTGATCTTGACC,下游引物5CAATGCCTACGGAGATAAAAGAC;

标记2BPPCT004,其上游引物5CTGAGTGATCCATTTGCAGG,下游引物5AGGGCATCTAGACCTCATTGTT;

标记3BPPCT032,其上游引物5TTAAGCCACAACATCCATGAT,下游引物5AATGGTCTAAGGAGCACACG;

标记4BPPCT036,其上游引物5AAGCAAAGTCCATAAAAACGC,下游引物5GGACGAAGACGCTCCATT;

标记5BPPCT040,其上游引物5ATGAGGACGTGTCTGAATGG,下游引物5AGCCAA ACCCCTCTTATACG;

标记6Pchgms1,其上游引物5GGGTAAATATGCCCATTGTGCAATC,下游引物5GGATCATTGAACTACGTCAATCCTC;

标记7Pchgms3,其上游引物5ACGGTATGTCCGTACACTCTCCATG,下游引物5CAACCTGTGATTGCTCCTATTAAAC;

标记8Pchgms10,其上游引物5CGTCACGCATCCTTTCATTT,下游引物5GACACCTCCATTTGTATCAAAGC;

标记9Pchgms11,其上游引物5TTGAGGCCCACTTATTAGCC,下游引物5CCCCCATTATTCAAACTTCTG;

标记10Pchgms21,其上游引物5ACCACCATTTTGGCTCTCTG,下游引物5CATGCAACCCAAAACCATCT;

e、SSR一PCR扩增反应、电泳检测:SSR-PCR反应体系20μl反应体系包含:10×Taq酶配 套缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPS,SSR上下游引物各为0.2mol/μl,0.5U TaqDNA聚合酶,DNA模板30ng,相应的扩增程序为:温度94℃预变性,4min,然后是温度 94℃变性60s,温度55℃复性40s,温度72℃延伸60s,共34个循环后,温度72℃延伸8 min补齐,扩增产物中加入6倍的Loadingbuffer2.0μl,取2.5μl上样,用8%非变性聚丙烯酞 胺凝胶电泳检测,银染显色;

f、统计分析:基于不加权配对组算术方法的聚类分析用NTSYS-pc2.10e软件进行数据 分析,选择清晰可辨的电泳带,样品有带则记为1,无带则记为0,构建二态数据矩阵;对原始 矩阵用SimQual程序求SSM相似系数及遗传距离矩阵,并用SAHN程序中的UPGMA方法进行聚类 分析,基于Wagner简约法的聚类分析用PHYLIP3.65软件包中SEQBOOT、MIX、CONSENSE等程序 作出一致性树图,并用TreeView1.6程序生成简约图,构建分子进化系统树。

下载完整专利技术内容需要扣除积分,VIP会员可以免费下载。

该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于新疆农业大学,未经新疆农业大学许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服

本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201510870315.6/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。

×

专利文献下载

说明:

1、专利原文基于中国国家知识产权局专利说明书;

2、支持发明专利 、实用新型专利、外观设计专利(升级中);

3、专利数据每周两次同步更新,支持Adobe PDF格式;

4、内容包括专利技术的结构示意图流程工艺图技术构造图

5、已全新升级为极速版,下载速度显著提升!欢迎使用!

请您登陆后,进行下载,点击【登陆】 【注册】

关于我们 寻求报道 投稿须知 广告合作 版权声明 网站地图 友情链接 企业标识 联系我们

钻瓜专利网在线咨询

周一至周五 9:00-18:00

咨询在线客服咨询在线客服
tel code back_top