[发明专利]超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，超声微泡介导的siRNA干扰GRK4在靶向调节尿钠排泄及血压水平中的应用。

背景技术

高血压及其并发症正成为影响人民健康的主要原因。肾脏是负责尿钠排泄的重要器官，在高血压研究中得到普遍重视。在血压调控的众多因素中，G蛋白偶联受体激酶4(Gprotein-coupledreceptorkinases4，GRK4)近年来尤其引人关注。首先，GRK4定位于染色体的4pl6.3，这一区域被认为与人类原发性高血压的发病具有密切关系；而GRK4已知的多个SNPs位点也与高血压的发病具有直接关联。其次，不同于GRK家族其他成员，如GRK2、GRK3、GRK5和GRK6的广泛组织表达，GRK4的组织表达具有特异性，前期研究发现GRK4特异性的在肾脏、睾丸、子宫肌层和血管等有限组织中表达。更为重要的是，GRK4可通过磷酸化相应G蛋白偶联受体，改变相应受体的功能，比如：增加引起水钠潴留的血管紧张素II受体I(AT₁R)增加，并引起这些受体的磷酸化水平改变，进而使受体介导的肾脏排钠利尿受损/水钠潴留效应增强，从而引起血压升高。GRK4活性增高是众多受体功能异常的原因，因此，GRK4已经成为高血压治疗关注的新靶点。如何有效抑制GRK4的活性及效应已成为高血压研究与治疗领域的新的热点。

随着人类基因组学和分子生物学的发展，与治疗相关的基因、受体、配体等被大量发现，基因治疗高血压正逐渐成为目前国内外研究的热点。如何将目的基因安全、有效、靶向性地导入体内特定器官、组织，并在靶细胞内稳定表达是目前亟待解决的主要难题之一。目前基因转染方法可分为三类：(1)生物法：主要指病毒载体介导的基因转染；(2)化学法：包括磷酸盐沉淀、脂质体包埋等；(3)物理法：包括电穿孔、裸露DNA直接注射等。其中，病毒载体具有较高基因转染效率，但存在免疫原性及与宿主细胞整合的潜在危险，其安全性及免疫原性所致的不良后果令人担忧。脂质体包埋等方法具有低毒、低免疫原反应等优点，但有基因转染效率低、基因不能长期稳定表达等不足。电穿孔等物理方法对组织损伤大，且安全参数难以确定。相比较而言，超声介导微泡破裂技术既安全又高效，应用前景令人期待。具体地，超声介导微泡破裂(ultrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)技术是将载有目的基因的微泡造影剂经静脉注射后，在靶组织给予一定条件的超声照射，引起微血管损伤，使血管内的微泡破裂并释放基因，同时产生“空化效应”和“声孔效应”，使毛细血管穿透性及细胞膜通透性增加，从而促进释放基因大量进入靶细胞，使微泡或释放的基因能够进入血管壁及组织间隙，进而发挥靶向治疗作用。研究表明，联合使用超声照射和微泡可明显提高基因的转染率。超声微泡技术具有3个特点：(1)安全性：超声造影剂是一种高浓度微泡的混悬液，对人体无毒副作用；(2)靶向传输：采用治疗性超声或诊断性超声进行照射，使微泡崩塌破裂后，靶向释放出所携带的基因；(3)促渗透作用：微泡破裂会产生空化效应，导致膜通透性一过性升高，产生的微射流等可促进药物或基因运输。正是上述突出优点，使得超声微泡技术显得格外引人关注。

在超声微泡技术中，微泡是超声靶向造影剂的主要成分，包括外壳和内充气体。新型微泡内充气体以六氟化硫、氟碳、氮等高分子惰性气体为主；包裹微气泡的外壳主要有脂类、白蛋白类、多聚体类及表面活性剂类，可增加微泡稳定性，延长在血液循环系统中的停留时间。近年来，在心血管疾病、糖尿病肾病或肾肿瘤中均有关于超声微泡介导的靶向治疗，但是在肾脏尿钠代谢以及高血压研究领域中，超声微泡技术介导的基因治疗的应用尚未见报道。

RNA干扰(RNAinterfering，RNAi)可以高效的抑制特定基因，因其毒性较低，在基因治疗研究中具有重要地位，技术也日趋成熟。siRNA(smallinterferingRNA，siRNA)是RNAi作用的中心环节和效应分子。siRNA的作用是以同源互补序列的mRNA为靶目标，促使mRNA降解，可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱导基因沉默效应。依照此原理，针对目标基因的信使RNA，设计并合成特异性siRNA，可以封闭特定基因的表达。与其他基因一样，siRNA要成功运输，需经历3个阶段：细胞外运输、细胞摄取和细胞内运输。到目前为止，在肾脏中尚未见利用siRNA技术针对GRK4进行干扰，进而改变肾脏尿钠排泄水平的报道。

发明内容