[发明专利]一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红Ⅰ抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红Ⅰ特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红Ⅰ多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的全抗原包括苏丹红Ⅰ-KLH和苏丹红Ⅰ-BSA。

3.根据权利要求2所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的全抗原，其制备方法包括以下步骤：

(1)先用十二烷基硫酸钠分别变性钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(2)再分别用热的二硫苏糖醇对变性后的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白进行还原，然后分别用葡聚糖凝胶脱盐后，得到巯基化的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(3)分别再用饱和碳酸钠溶液调pH＝8.5，然后滴入已制备好的3/8体积的活性苏丹红Ⅰ组分与钥孔血蓝蛋白，室温反应1h，再经葡聚糖凝胶脱盐后，即制得苏丹红Ⅰ-KLH全抗原，已制备好的1/8体积的活性苏丹红Ⅰ组分与牛血清蛋白同样操作反应即制得苏丹红Ⅰ-BSA全抗原。

4.根据权利要求3所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的全抗原苏丹红Ⅰ-KLH做注射用；所述的全抗原苏丹红Ⅰ-BSA做检测包被用。

5.根据权利要求3所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的活性苏丹红Ⅰ组分，其制备方法包括以下步骤：

(1)将苏丹红Ⅰ标准品溶解于无水氯仿中，在无水氯化铝的作用下与溴乙酰氯反应，得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅰ混合物；

(2)将得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅰ混合物用制备型高效液相反向柱色谱分离纯化，收集具有苏丹红Ⅰ标准品紫外光吸收光谱特征的活性苏丹红Ⅰ组分；

(3)将所收集的活性苏丹红Ⅰ组分重新萃取到氯仿中，经旋转蒸发后再用丙酮复溶后备用。

6.根据权利要求5所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的活性苏丹红Ⅰ组分按体积分为2等份，一份用于制备全抗原，另一份用于制备抗原免疫亲和填料。

7.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的免疫动物为新西兰大白兔。

8.根据权利要求1所述的苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(1)取2g赖氨酸溶于10mL0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

(2)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

(3)先用50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(4)取现配的150mgNHS-碘乙酸活性酯，边振荡边加入至步骤(3)得到的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温避光反应60min；

(5)去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用100mL100％丙酮洗1次，当溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/LHCL的50mL50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

(6)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(7)取1/2体积的活性苏丹红Ⅰ组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基琼脂糖珠填料室温反应过夜；

(8)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料。