[发明专利]一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫技术领域，具体的说是涉及一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法。

背景技术

苏丹红学名苏丹(Sudan)，共分为苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ。苏丹红为亲脂性偶氮染料，主要用于油彩、机油、蜡和鞋油等产品的染色。由于用苏丹红染色后的食品颜色非常鲜艳且不易褪色，能引起人们强烈的食欲，一些不法食品企业把苏丹红添加到食品中。常见的添加苏丹红的食品有辣椒粉、辣椒油、红豆腐，红心禽蛋等。

由于苏丹红是一种人工合成的一种工业染料，1995年欧盟(EU)等国家已禁止其作为色素在食品中进行添加，对此我国也明文禁止。但由于其染色鲜艳，印度等一些国家在加工辣椒粉的过程中还容许添加苏丹红I。EU对从印度进口的红辣椒粉中检出苏丹红，其检出苏丹红I的量为2.8-3500mg/kg。同时在一些其它食品中也检测到这种物质，如一些调味品中苏丹红I的含量达到0.7-170mg/kg。也有一些报道称，在辣椒粉中还可检测到苏丹红Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ，如在辣椒粉和辣椒酱中检出苏丹红IV的含量分别为230和380mg/kg，但辣椒粉中一般多以检出苏丹红I为主。英国食品标准局(TheFoodStandardAgency，FSA)就含有添加苏丹红色素的食品向消费者发出警告，并在其网站上公布了可能含有苏丹红I的产品清单。截至2月24日，清单上的产品增加到了474种，包括香肠、泡面、熟肉、馅饼、辣椒粉、调味酱等产品。

欧洲调味品协会专家委员会(theExpertCommitteeonFlavouringsoftheCouncilofEurope)的资料信息显示，欧洲每天红辣椒粉的人均消费量为50-500mg，而红辣椒粉中苏丹红I的检出量为2.8-3500mg/kg，从而推算欧洲人每天苏丹红I的人均可能摄入量为0.14-1750μg。而在法国向欧洲调味品协会专家委员会提交的一份报告中指出，人均每天辣椒(包括红辣椒和辣椒粉)的消费量和最大消费量分别为77和264mg，按辣椒粉中苏丹红I的检出量2.8-3500mg/kg进行推算，则欧洲人每天人均苏丹红I的摄入量为0.2-270μg，最大摄入量为0.7-924μg。

鉴于苏丹红Ⅰ给人类带来健康的潜在风险，开发一种简单、快捷制备用于检测苏丹红Ⅰ的多克隆抗体显得尤为重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法。

本发明提供的技术方案为：

一种苏丹红Ⅰ多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将制备好的全抗原注射到免疫动物体内；

(2)再加强免疫3次后采血，检测血清效价；

(3)若血清效价达到要求，则大量采血，离心取上清，得到抗血清；

(4)将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗苏丹红Ⅰ抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上的活性苏丹红Ⅰ特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得到抗苏丹红Ⅰ多克隆抗体。

作为优选，步骤(1)中所述的全抗原包括苏丹红Ⅰ-KLH和苏丹红Ⅰ-BSA。

作为优选，所述的全抗原，其制备方法包括以下步骤：

(1)先用十二烷基硫酸钠分别变性钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(2)再分别用热的二硫苏糖醇对变性后的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白进行还原，然后分别用葡聚糖凝胶脱盐后，得到巯基化的钥孔血蓝蛋白或牛血清蛋白；

(3)分别再用饱和碳酸钠溶液调pH＝8.5，然后滴入已制备好的3/8体积的活性苏丹红Ⅰ组分与钥孔血蓝蛋白，室温反应1h，再经葡聚糖凝胶脱盐后，即制得苏丹红Ⅰ-KLH全抗原，已制备好的1/8体积的活性苏丹红Ⅰ组分与牛血清蛋白同样操作反应即制得苏丹红Ⅰ-BSA全抗原。

作为优选，所述的全抗原苏丹红Ⅰ-KLH做注射用；所述的全抗原苏丹红Ⅰ-BSA做检测包被用。

作为优选，所述的活性苏丹红Ⅰ组分，其制备方法包括以下步骤：

(1)将苏丹红Ⅰ标准品溶解于无水氯仿中，在无水氯化铝的作用下与溴乙酰氯反应，得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅰ混合物；

(2)将得到具有活性的溴乙酰氯苏丹红Ⅰ混合物用制备型高效液相反向柱色谱分离纯化，收集具有苏丹红Ⅰ标准品紫外光吸收光谱特征的活性苏丹红Ⅰ组分；