[发明专利]一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、制备大肠杆菌菌液抗原：将导致仔猪腹泻的大肠杆菌分离常规培养后经化学灭活或巴氏灭活后，离心分离收集菌体，再用生理盐水洗涤后，稀释成10⁶-10¹⁰CFU/ml的菌液得菌液抗原；

(2)、制备疫苗原液：每1ml的菌液抗原中加入0.5-1mg的疫苗佐剂混匀，所述疫苗佐剂为基因工程表达的重组霍乱毒素B亚单位蛋白；

(3)、制备疫苗成品：在疫苗原液中加入质量为疫苗原液质量的3-5％甘露糖或甘露醇，分装后冻干。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的重组霍乱毒素B亚单位蛋白的纯度不低于70％，蛋白浓度为1-10mg/ml。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的重组霍乱毒素B亚单位构建包括：1)、设计相应引物扩增该片段；2)：构建重组质粒pET28a(+)/CTB,将其转化宿主大肠杆菌并做PCR、双酶切和测序鉴定,筛选出阳性克隆，表达产物经SDS-PAGE及Westernblot，分别测定其大小和特异性；3)、高效表达rCTB，再将rCTB纯化；4)、真空冷冻干燥重组工程菌备用。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的离心转速为6000-8000rpm，离心时间10-15min。

5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的疫苗，其特征在于，常规冻干后为白色疏松体，且加入蒸馏水3-8分钟能完全溶解。

6.如权利要求5所述的疫苗的应用方法，其特征在于，按0、14、28、42天的免疫程序，肌肉注射或口服总共免疫4次使用，每次免疫前将疫苗用蒸馏水复溶，肌肉注射免疫：每g动物体重4ul-40ul、菌量为10⁶-10¹⁰CFU/ml的疫苗；口服免疫：将1-10ml菌量为10⁶-10¹⁰CFU/ml的疫苗搅拌至温度低于室温的食品中喂食待免疫动物。