[发明专利]一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药中的预防用动物疫苗领域，具体地，涉及一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法。

背景技术

仔猪腹泻是集约化养猪生产条件下的一种典型的多因素性疾病，是目前最严重的仔猪疾病群之一，也是引起仔猪死亡的重要原因，据调查，仔猪因腹泻死亡占仔猪死亡总数的39.8％。30kg以下的仔猪，全年平均发病率46.5％，死亡率10.3％。仔猪腹泻在养猪业危害中居首位，严重威胁着养猪业的健康发展，导致饲料报酬率较低、仔猪成活率下降、生长缓慢、生长发育停滞(即所谓的僵猪)，甚至死亡。

致病性大肠杆菌是仔猪致病菌之一。疫苗免疫是控制大肠杆菌病的主要方法。从动物体分离或实验室保存鉴定的大肠杆菌菌株，经扩增培养，配制成适当浓度，用甲醛灭活，使大肠杆菌失去毒力但又保持免疫原性，制成灭活疫苗。在疫苗中添加白油佐剂或氢氧化铝胶剂，有利于增强疫苗的免疫效果。

疫苗防治采用菌种培养-灭活后添加氢氧化铝制得的悬浮液体疫苗，这种免疫疫苗添加的氢氧化铝使用后残留量大，不利于肉质类家禽使用，并且现有的疫苗存在免疫效果不佳问题，需要提供一种增强免疫效果的疫苗来预防仔猪腹泻。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，该方法通过将仔猪腹泻大肠杆菌鉴定后作为疫苗抗原菌株；将该疫苗菌株常规培养后，然后收集细菌，用巴氏灭菌或甲醛灭菌，灭活培养的疫苗活菌,然后溶生理盐水或其他溶液再调整灭活菌浓度，用紫外分OD₅₇₀测定在灭活的菌菌浓度在0.8-1.0范围内，每1ml的菌液抗原中加入0.5-1mg的基因工程霍乱毒素B亚单位佐剂到疫苗中配置成疫苗原液，最后在疫苗原液中添加质量为疫苗原液质量的3-5％的甘露糖或甘露醇，用玻璃瓶等分装后冻干灭活疫苗，可常温保存12-18个月或低温长期保存。该灭活疫苗经过4次免疫，能够有效的提高血液和肠液抗体IgG/IgA的量，达到了既可口服免疫也可肌肉注射免疫，减少了疫苗肌肉注射的免疫量，提高了免疫保护性。冻干疫苗实现了疫苗运输和保存对温度的过度依赖，免疫选择方便。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

一种新佐剂仔猪大肠杆菌灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)、制备大肠杆菌菌液抗原：将导致仔猪腹泻的大肠杆菌分离，常规培养鉴定合格后经化学或巴氏灭活后，离心分离收集菌体，再用生理盐水洗涤后，稀释成10⁶-10¹⁰CFU/ml的菌液得菌液抗原；

(2)、制备疫苗原液：每1ml的菌液抗原中加入0.5-1mg的疫苗佐剂混匀，所述疫苗佐剂为基因工程表达的重组霍乱毒素B亚单位蛋白；

(3)、制备疫苗成品：在疫苗原液中加入质量为疫苗原液质量的3-5％甘露糖或甘露醇，分装后冻干。

需要强调的是，加入甘露醇的量和CTB的量需要配合才能起到免疫效果。

步骤(2)中的重组霍乱毒素B亚单位蛋白的纯度不低于70％，蛋白浓度为1-10mg/ml。

步骤(2)中的重组霍乱毒素B亚单位的构建包括：1)、设计相应引物扩增该片段；2)：构建重组质粒pET28a(+)/CTB,将其转化宿主大肠杆菌并做PCR、双酶切和测序鉴定,筛选出阳性克隆，表达产物经SDS-PAGE及Westernblot，分别测定其大小和特异性；3)、高效表达rCTB，再将rCTB纯化；4)、真空冷冻干燥重组工程菌备用。rCTB即为重组霍乱毒素B亚单位。

步骤(1)中的离心转速为6000-8000rpm，离心时间10-15min。

如上述的制备方法制得的疫苗，常规冻干后为白色疏松体，且加入蒸馏水3-8分钟能完全溶解。

如上所述的疫苗的应用方法为：按0、14、28、42天的肌肉注射或口服免疫总共4次。每次免疫前将疫苗用蒸馏水复溶，肌肉注射免疫：每g动物体重4ul-40ul菌量为10⁶-10¹⁰CFU/ml的疫苗；口服免疫：将1-10ml菌量为10⁶-10¹⁰CFU/ml的疫苗搅拌至温度低于室温的食品中喂食待免疫动物(每kg动物体重)。

综上，本发明的有益效果是：

1.本发明通过无数次实验对菌液浓度、菌液中添加的佐剂量以及甘露醇量进行合理配比，能够保证疫苗在免疫过程中引发较好的免疫反应，而避免免疫耐受、成型不好或者不良反应的问题出现。