[发明专利]一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法

权利要求书

1.一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：

1)采集桑树春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；

2)将桑枝粉用石油醚溶液和乙醇进行脱脂、除苷类和生物碱后获得桑枝粉残渣；

3)将桑枝粉残渣加入双蒸馏水，从桑枝中提取出粗多糖；

4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质，并用乙醇进行两次沉淀；

5)接着依次通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱分离洗脱、通过SephacrylS-100层析柱除盐洗脱、通过SephacrylS-300层析柱纯化洗脱后，收集第1个洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分RMPW-1。

2.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤2)将桑枝粉进行脱脂、除苷类和生物碱具体为：

2.1)取桑枝粉，按质量体积比(W：V)为1:10加入石油醚溶液，在90℃下回流脱脂1h后抽滤；

2.2)取残渣用10倍体积质量浓度为80％乙醇在100℃下回流1h后抽滤；

2.3)重复上述步骤2.2)一次，然后取残渣于40℃烘箱中烘干。

3.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤3)加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖具体为：

3.1)将烘干桑枝粉残渣按质量体积比(W：V)为1：10加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h抽滤，获得残渣和滤液；

3.2)取步骤3.1)得到的残渣再重复上述步骤3.1)一次，获得残渣和滤液；

3.3)合并步骤3.1)和步骤3.2)得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，从而从桑枝中提取出粗多糖。

4.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质具体为：

将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇。

5.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤4)第一次用乙醇进行沉淀具体为：

将除去蛋白质的粗多糖溶液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖。

6.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤4)第二次用乙醇进行沉淀具体为：

将第一次沉淀后的多糖按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。

7.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤5)通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱洗脱分离具体为：将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱用0.1MNaCl液以3.0-3.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分，取名为RMPW。

8.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤5)通过SephacrylS-100层析柱除盐洗脱具体为：

将酸性多糖组分RMPW用双蒸馏水溶解配制成10mg/mL溶液，过0.22μm滤膜，上SephacrylS-100层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩成浓度为10mg/mL。

9.根据权利要求1所述的一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，其特征在于：所述步骤5)通过SephacrylS-300层析柱洗脱纯化具体为：

将所述SephacrylS-100层析柱除盐洗脱后得到的浓缩液上SephacrylS-300层析柱用双蒸馏水以0.5-0.7mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集第1个洗脱峰的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到均一的多糖组分，取名为RMPW-1。