[发明专利]一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种多糖的制备方法，尤其是涉及了一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法。

背景技术

多糖(polysaccharide)又称多聚糖，是由单糖聚合而成并且聚合度大于10的极性复杂大分子，分子量一般为数万甚至数百万。多糖是继蛋白质、核酸之后，又一携带大量生物信息的生物大分子，来源于真菌、藻类地衣、植物、细菌、动物等。大量的药理和临床研究表明，天然多糖具有有效的抗癌作用，而且毒副作用较小，展现出广阔的研究和应用前景。

桑枝(Ramulusmori)是桑科植物桑(Morusalba)的干燥枝条，性平味苦，入肝、脾、肺、肾经，一直是民间常用中药。研究表明，桑枝多糖具有降血糖、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种药理活性，但药用机理尚不清楚，这阻碍了桑枝药用水平提高及药用范围扩大。分离纯化制备桑枝抗肿瘤活性成分，对于推进桑枝药用开发具有积极的现实意义。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供了一种桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1的制备方法，是采用回流提取、DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱分离和SephacrylS-100、S-300层析柱纯化的方法，制备桑枝抗肿瘤活性多糖RMPW-1。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)采集桑树春季新生嫩桑枝或春季老桑枝，太阳光下自然晒干，切片，于40℃烘箱中烘干至恒重，高速粉碎机粉碎后过80-100目筛，得到桑枝粉；

2)将桑枝粉经石油醚回流脱脂、经乙醇回流除去苷类和生物碱等小分子物质后获得桑枝粉残渣；

3)将桑枝粉残渣加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖；

4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质，并用乙醇进行两次沉淀；

5)接着依次通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱分离洗脱、通过SephacrylS-100层析柱除盐洗脱、通过SephacrylS-300层析柱纯化洗脱后，收集第1个洗脱峰的洗脱液，得到多糖组分RMPW-1。

所述步骤2)将桑枝粉进行脱脂、除苷类和生物碱具体为：

2.1)取桑枝粉，按质量体积比(W：V)为1:10加入石油醚溶液，在90℃下回流脱脂1h后抽滤；

2.2)取残渣用10倍体积质量浓度为80％乙醇在100℃下回流1h后抽滤；

2.3)重复上述步骤2.2)一次，然后取残渣于40℃烘箱中烘干。

所述步骤3)加入双蒸馏水从桑枝中提取出粗多糖具体为：

3.1)将烘干桑枝粉残渣按质量体积比(W：V)为1：10加入双蒸馏水，超声波处理40min后，于100℃下提取2h抽滤，获得残渣和滤液；

3.2)取步骤3.1)得到的残渣再重复上述步骤3.1)一次，获得残渣和滤液；

3.3)合并步骤3.1)和步骤3.2)得到的滤液，在50℃减压浓缩至原体积的1/3，从而从桑枝中提取出粗多糖。

所述步骤4)将粗多糖用Sevag法除去蛋白质具体为：

将粗多糖液用Sevage溶液反复除蛋白多次直到碘颜色反应和茚三酮反应均检测不到蛋白质，Sevage溶液中氯仿:正丁醇的质量比为4:1，然后于50℃下减压浓缩并除去氯仿和正丁醇。

所述步骤4)第一次用乙醇进行沉淀具体为：将除去蛋白质的粗多糖溶液中加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到80％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，获得第一次沉淀后的多糖。

所述步骤4)第二次用乙醇进行沉淀具体为：将第一次沉淀后的多糖按质量体积比(W：V)为1:5加入双蒸馏水溶解，加入无水乙醇，边加边搅拌，至乙醇浓度达到60％，置4℃冰箱过夜，8000rpm离心10min，得到沉淀多糖。

所述步骤5)通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱洗脱分离具体为：将沉淀多糖用双蒸馏水溶解配制成20mg/mL溶液，8000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上DEAE-SepharoseFastFlow离子交换层析柱用0.1MNaCl液以3.0-3.4mL/min流速洗脱，洗脱时用自动收集器收集，再用苯酚-硫酸法检测收集有显色反应的洗脱液，40℃下减压浓缩，-50℃下真空冷冻干燥，得到酸性多糖组分，取名为RMPW。