[发明专利]一种乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的乙型流感病毒检测试剂盒，其特征是试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、M片段阳性质粒Puc-NS、阴性质控品、NS片段RPA引物和exo探针组成，NS片段RPA引物和exo探针为：

NS-F,5'-AAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGG-3'；

NS-R,5`-CCATGTCAGCTATTATGGAGCTGTTAACTA-3`；

NS-exo-probe,5`-CCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAA[dT-FAM]TA[THF]AC[dT-BHQ]GGTCACGGAAGAAC[3`-block]-3`。

2.根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的乙型流感病毒检测试剂盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成：

(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；

(2)RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF10mM和L-RPAR10mM各2.1μL，2.6μLRPAexo探针10mM，1μLRNA酶抑制剂5U,7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板；涡旋震荡，短暂离心，再加入2.5μL醋酸镁280mM；混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。