[发明专利]一种乙型流感病毒核酸检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乙型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

乙型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个负链单股RNA节段组成，主要感染人和海豹。根据病毒表面蛋白血凝素抗原性差异，乙型流感病毒分为Victoria系和Yamagata系。乙型流感病毒在人群中引起暴发和流行，是人类季节性流感病毒主要成员，可以感染所有人群，对一些特殊人群(如孕妇、老年人和基础性疾病患者)能引起严重疾病乃至死亡。乙型流感病毒的检测方法主要包括血清学和核酸检测，血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行抗原分型，耗时费力，不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法和Real-timetimePCR法等。Real-timetimePCR法具有很好的特异性和敏感性，但依赖昂贵的仪器和试剂；相比之下，普通PCR敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定，不适合大规模标本的检测。因此，需要建立快速、敏感、便于推广的乙型流感核酸检测方法，以提高流感监测和临床诊断水平。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种乙型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。

本发明提供的乙型流感病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体系、NS片段阳性质粒Puc-NS、阴性质控品、NS片段RPA引物和exo探针组成。

NS片段RPA引物和exo探针为：

NS-F,5'-AAAGCCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTGG-3'；

NS-R,5`-CCATGTCAGCTATTATGGAGCTGTTAACTA-3`；

NS-exo-probe,5`-CCGATTATCACCAGAAGAGGGAGACAA[dT-FAM]TA[THF]AC[dT-BHQ]GGTCACGGAAGAAC[3`-block]-3`

本发明所述乙型流感病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法：

(1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1.5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20℃静置2h；取出于4℃下，12000g，离心20min；弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，12000g，离心20min；弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70℃冰箱放置备用；

(2)RT-RPA反应：采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-RPAF(10mM)和L-RPAR(10mM)各2.1μL，2.6μLRPAexo探针(10mM),1μLRNA酶抑制剂(5U),7.2μL超纯水，5μL标本RNA模板，涡旋震荡，短暂离心，再加入2.5μL醋酸镁(280mM)，混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40℃，时间为20min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

设计针对L片段RPA引物和exo探针，通过反转录-重组酶多聚酶扩增方法，反应温度为40℃等温条件下，20min即可对临床上发热伴血小板减少综合征病毒标本和病毒分离物进行核酸分子鉴定，无需昂贵仪器设备，便于操作，具有快速、敏感、特异等特点，为发热伴血小板减少综合征病毒监测和临床救治提供一种新的检测方法。

附图说明

图1检测乙型流感病毒NS节段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选

具体实施方式

下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。

实施例1：靶基因质粒构建

设计针对乙型流感病毒NS片段的特异性引物，通过PCR法扩增获得806基因片段，回收纯化后的与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，命名为Puc-NS。

实施例2：引物探针设计与筛选