[发明专利]一套用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测的多核苷酸、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)检测的多核苷酸、方法和试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌是医院获得性感染最常见的致病菌之一，随着抗菌药物的广泛应用，尤其是随着广谱抗生素的广泛使用，金黄色葡萄球菌耐药菌株不断出现，且呈多重耐药性。自1961年第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)被发现以来，MRSA的感染率和分离率不断增加，在全世界范围内广泛传播，常造成医院感染的暴发流行。MRSA的主要耐药机制为细菌获得一种能够编码青霉素结合蛋白(PBP2a)的mecA基因，使其对β-内酰胺类、氟喹诺酮类、大环内酯类等抗生素的耐药率均较高，呈多重耐药性。近年来，世界各地分离的MRSA占金黄色葡萄球菌的比率呈逐年上升趋势。法国、日本等国MRSA的检出率均在30％以上，MRSA感染已与乙型肝炎、获得性免疫缺陷综合征并列世界范围内三大最难解决的感染性疾患。

聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)具有快速、简易、稳定的特点，对快速鉴定MRSA具有重要意义，常用的包括普通PCR检测及实时荧光PCR检测方法。常规PCR检测方法具有较高的敏感性和良好的特异性，可以满足临床对普通标本的检测；实时荧光PCR方法检测细菌数的下限很低，灵敏度远高于普通PCR。此外，临床实时荧光PCR可根据Ct值和模板拷贝数之间的线性关系计算样品模板的DNA表达水平。因此，实时荧光PCR可以对样品中的目的基因进行精确定量，更适用于MRSA感染和环境监控的早期判断。

质粒DNA标准物质是一种含有检测目的基因的特异性片段的重组质粒分子，在PCR定性检测中可以作为阳性对照，在PCR定量分析中可以作为定量分析的标准品，构建定量分析的标准曲线。但是由于受到DNA定量检测量值溯源水平的限制，目前可查的质粒DNA标准物质还比较少，针对MRSA检测的质粒DNA标准物质还是空白。在生物计量科学领域，质粒DNA标准物质研究受到广泛重视，参与该领域研究的国际国内单位包括美国的国家标准技术研究院(NIST)，英国政府检测标准集团(LGC)，欧盟委员会联合研究中心标准物质与测量研究院(IRMM)以及中国计量科学技术研究院等，至今已经有5个质粒有证标准物质研发成功。由于针对MRSA的PCR相关检测方法的质粒DNA标准物质的研制还是空白，在实际MRSAPCR检测时，各单位使用的多是自行设计构建的质粒DNA分子作为标准品，其中的目的基因特异性片段各不相同，同时缺乏统一的定值方法，质粒DNA分子定值准确度差，造成各实验室之间的检测结果差异极大，缺乏可比性、有效性和可靠性。

发明内容

本发明的目的在于提供一套适用于MRSA实时荧光定量PCR检测的质粒标准分子及其应用。

本发明的第一方面，提供了一套分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含MRSA的mecA基因序列。

在另一优选例中，所述MRSA的mecA基因序列选自下组：

(a)序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸序列；

(b)核苷酸序列与SEQIDNO.:1所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)的多核苷酸序列；

(c)序列与SEQIDNO.:1所示多核苷酸完全匹配或完全互补并且长度为SEQIDNO.:1所示序列长度的20％-100％(较佳地50％-100％，更佳地80％-100％，最佳地90％-100％，如95％)的多核苷酸序列；

(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述多核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示。

本发明的第二方面，提供了一套分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、启动子序列和/或载体序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物中包含MRSA的mecA基因序列。

在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。

在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒或表达载体。

在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为MRSA检测的标准分子(质粒标准分子)。

在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。