[发明专利]一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法

权利要求书

1.一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞荧光成像探针，其结构式为：

方法是：(1)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2～4范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的绿色荧光减弱；(2)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10～12范围的探针溶液，再将探针溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的红色荧光增强；(3)用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5～9范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像；上述所指极端pH值是指pH2～4、pH10～12。

2.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是用乙腈和缓冲溶液配制探针溶液的方法为：(1)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷和50mM的HCl溶液，用pH计调节，配成pH＝2～9的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加三羟甲基氨基甲烷HCl缓冲溶液900μL，配制成pH＝2～9的不同pH值的探针溶液；(2)用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和50mM的NaOH溶液，用pH计调节，配成pH＝10～12的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加4-羟乙基哌嗪乙磺酸NaOH缓冲溶液900μL，配制成pH＝10～12的不同pH值的探针溶液。

3.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是探针与活性细胞孵化的方法，是用人体前列腺癌细胞PC3，经复苏接种于含10％胎牛血清以及含1％双抗的培养基中，培养基为改良型RPMI-1640，在温度为37℃，5％CO₂以及饱和湿度为100％的培养箱中培养，每隔2-3天传代1次，选择生长状态良好的细胞接种于12孔板中培养，密度为2×10⁴个/ml，次日用新鲜培养基清洗细胞两次，将细胞分别浸入含不同pH值的探针培养液中，在培养箱中孵育，使不同pH值的缓冲溶液配制的探针对细胞染色，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞，然后用荧光显微镜检测。

4.根据权利要求1所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是探针与细胞的孵化过程中，控制探针的浓度在10～100μM范围，探针能很好渗透到活体PC3细胞内，细胞呈圆润饱满状，探针与细胞具有良好的相容性，探针与细胞的孵化时间在20～30min内未见细胞凋亡，探针对细胞无毒性；荧光显微镜检测时，在pH为2～4的范围，用荧光显微镜的绿色通道，激发波长为450～490nm检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像；在pH为10～12的范围，用荧光显微镜的红色通道，激发波长为510～550nm检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像；在pH为5～9的范围，用荧光显微镜的红色或绿色通道检测，不显现细胞图像。

5.根据权利要求1或2或3所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是所用的试剂为分析纯或生化试剂，所用水为二次蒸馏水或生理盐水；所用活性PC3细胞为人体前列腺癌细胞；所用的拍照设备为荧光倒置显微镜。

6.根据权利要求1或2或3所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法，其特征是利用所述探针的荧光成像方法对活性细胞内pH检测：活性PC3细胞经复苏、传代、接种、培养、清洗后，将细胞分别浸入pH为3.6或pH为10.6的50mM缓冲溶液中，在37℃，5％CO₂以及饱和湿度为100％的培养箱中孵育5～10min，吸出含不同pH值的缓冲溶液，用新鲜培养基清洗细胞3次；用荧光显微镜检测；再将上述细胞浸入含10μM探针的培养液中孵化1h，吸出含探针的培养液，用新鲜培养基清洗细胞3次，用荧光显微镜检测；经pH为3.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到绿色荧光细胞图像；经pH为10.6的缓冲溶液孵化的细胞，观察不到细胞的荧光图像，该细胞再经探针孵化后，清晰地观察到红色荧光细胞图像。