[发明专利]一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法

说明书

本发明是一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞成像方法，属分析化学领域。以喹哪啶衍生物(E)‑2‑(2,4‑二羟基苯基)乙烯基‑8‑羟基喹啉，简称探针，为活性细胞中检测pH的荧光成像探针。先用乙腈和缓冲溶液分别配制pH为2~4、10~12的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光倒置显微镜检测，分别呈现绿色荧光、红色荧光的细胞图像，随pH值的变化，细胞的荧光颜色和强度都发生变化；而探针在pH为5~9范围，则观察不到细胞的荧光图像。探针的化学结构式为：

技术领域

本发明属分析化学领域，具体地说是一种利用荧光探针检测活性细胞中pH的方法。

背景技术

荧光探针与荧光显微技术的结合，使荧光探针在生物活性物质检测和细胞成像方面得到广泛应用。对生物活性物质而言，检出的灵敏度极限是单个分子而对测试技术有更高的灵敏度要求，同时也有更苛刻的测试条件要求。荧光成像分析是目前广泛应用于活细胞分析的一种高灵敏的可视化分析技术。活细胞成像技术是生命科学技术领域中重要的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。细胞生物学中量度细胞内的pH值、细胞的增殖和凋亡、细胞内吞作用、离子运输和动态平衡、多药抗药性，生物分析化学和医学健康血液中pH值等均与pH密切相关。目前用于活细胞成像分析的荧光探针多为有机荧光染料分子。在实际应用中，这些分子存在荧光寿命较短、容易猝灭及稳定性差的缺点。特别是大多数的质子化荧光探针的荧光随pH值的增大呈单一减弱变化，表现为酸性为“On”碱性为“Off”，极少数随pH值的增大呈单一增强变化，表现为酸性“Off”碱性“On”，很少有在能在强酸、强碱极端介质条件下实现细胞成像。已报道的有些类荧光探针荧光强度随pH变化会不同程度地受到共存于体系中的生物相关金属离子、阴离子及氨基酸、糖类等生物小分子的干扰。在极端pH下实现长时间的实时动态连续测定，提高细胞的可视化分析的选择性和精度是迫切需要解决的问题。具有良好的光稳定性、合适的水溶性及细胞膜通透性且对细胞无毒，而且能在不同酸、碱介质中能在细胞内发射不同波长强荧光的探针极为罕见。

发明内容

本发明的目的在于研究一种在极端pH值下对活性细胞成像的荧光探针新方法。是一种对pH高灵敏、高选择性检测识别的荧光探针，并能实现对活体细胞中氢离子的荧光染色和成像。

本发明一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是以喹哪啶衍生物(E)-2-(2,4-二羟基苯基)乙烯基-8-羟基喹啉，简称探针，作为极端pH值下的活性细胞荧光成像探针，其结构式为：

方法是：（1）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在2~4范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的绿色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的绿色荧光减弱；（2）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在10~12范围的探针溶液，再将探针溶液与活性细胞孵化后，用荧光显微镜检测，呈现清晰的红色荧光细胞图像，随pH值的增大，细胞的红色荧光增强；（3）用探针乙腈溶液和缓冲溶液配制pH在5~9范围的探针溶液，再将探针与活性细胞孵化后，荧光显微镜检测不到细胞的荧光图像；上述所指极端pH值是指pH2~4、pH10~12。

所述的一种利用荧光探针在极端pH值下的活性细胞荧光成像方法是用乙腈和缓冲溶液配制探针溶液的方法为：（1）用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的三羟甲基氨基甲烷Tris和50mM的HCl溶液，用pH计调节，配成pH=2~9的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加Tris-HCl缓冲溶液900μL，配制成pH=2~9的不同pH值的探针溶液；（2）用乙腈溶解探针试剂，配成探针浓度100μM的乙腈溶液；用浓度为50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES和50mM的NaOH溶液，用pH计调节，配成pH=10~12的不同pH值的缓冲溶液；取浓度为100μM的探针乙腈溶液100μL，加HEPES-NaOH缓冲溶液900μL，配制成pH=10~12的不同pH值的探针溶液。