[发明专利]一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的培养方法。具体涉及一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercells，CIK）是指经IFN-γ、CD3单克隆抗体、IL-2等细胞因子体外有序激活人外周血单核细胞（PeripheralBloodMononuclearCells，PBMC）而获得的异质免疫细胞群，于1991年被美国斯坦福大学Schmidt-Wolf首次发现并命名。因其具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点，被认为是新一代肿瘤过继免疫治疗的首选细胞群。然而，由于肿瘤病人的免疫功能处于抑制或免疫耗竭状态，传统CIK细胞培养技术在临床应用时个体差异较大，迫切需要建立新的培养技术，提高CIK细胞的扩增效率和杀伤活性。

人工抗原递呈细胞（artificialantigenpresentingcells，aAPC）通过模拟T细胞活化的双重信号机制，在一定的载体表面表达抗原肽-MHC分子复合物及共刺激分子、粘附分子的配体或抗体，能有效活化和扩增抗原特异性T细胞，且效率高、可行性好。ECCE（EngineeredCellsforCostimulatoryEnhancement）是通过表达人肿瘤坏死因子超家族分子9（humantumornecrosisfactorsuperfamilymember9，CD137L）的逆转录病毒感染K562细胞，并使其稳定表达而形成的新型aAPC。K562细胞不表达MHC分子，能够避免异体移植物的免疫排斥反应，因此ECCE细胞不同于其他的aAPC系统，能够应用于临床级别免疫细胞的制备。此外，ECCE细胞在进入CIK细胞培养体系前，经过100Gy伽马射线30分钟的灭活照射，因此，将ECCE细胞应用于制备临床级别的CIK细胞是安全的。

目前大多数的研究都尝试通过增加细胞因子（如IL-21等）刺激或通过与自体DC细胞共培养提高CIK细胞的增殖效率和杀伤活性，然而，对于经过放化疗、免疫功能低下的患者，其效果并不是很明显。利用aAPC激活免疫细胞，在制备临床级别的NK细胞、抗原特异性T细胞、γδT细胞有广泛的研究。本发明首次将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，明显增加了CIK细胞的增殖活性并提高了CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，有望扩大自体CIK细胞治疗肿瘤的临床应用范围并提高其疗效。

发明内容

本发明是为了解决传统CIK细胞培养个体差异大，无法获得足够数量高杀伤活性的CIK细胞的问题，提供一种ECCE-CIK细胞培养方法及ECCE-CIK细胞制剂，将ECCE细胞引入CIK细胞培养体系，大大提高传统CIK细胞的增殖活性和细胞毒活性，为临床自体CIK细胞治疗肿瘤提供了一种新的高效的CIK细胞培养方法，我们将这种高效能的CIK细胞简称为ECCE-CIK细胞。本发明有望提高自体CIK细胞治疗肿瘤的疗效。

本发明采用的技术手段为：

一种ECCE-CIK细胞培养方法，包括如下步骤：

1）分离人外周血单核细胞（PBMC）；

2）制备PBMC细胞悬液；

3）激活PBMC；

4）培养激活后的细胞；

5）收集细胞；

步骤1）中所述的分离人PBMC是采用Ficoll密度梯度离心法。

步骤2）中所述的制备PBMC细胞悬液是用无血清淋巴细胞培养液将PMBC浓度调整到1.0*10⁶个/mL浓度接种于培养瓶中。

步骤2）中所述的无血清淋巴细胞培养液为：德国美天旎公司的TexMACSGMPMedium。

步骤3）中所述的激活PBMC的方法如下：

①在步骤2）制备的细胞悬液中加入IFN-γ（终浓度1000-2000U/mL）、经伽马射线灭活的ECCE细胞（终浓度为10⁵-10⁶个ECCE细胞/mL），置于37℃、5%CO₂、湿度100%培养箱内培养24小时；

②加入anti-CD3单克隆抗体（终浓度50-100ng/mL）、IL-2（终浓度300-1000U/mL），置于37℃、5%CO₂、湿度100%培养箱内继续培养；

步骤4）中所述的培养激活后的细胞是指根据细胞增殖的速度，每2-3天添加含有IL-2（终浓度300-1000U/mL）的无血清淋巴细胞培养液。