[发明专利]一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法

权利要求书

1.一种从发酵液中提取并纯化米尔贝霉素的方法，包括以下步骤：

1)将米尔贝霉素发酵液进行絮凝、过滤，得到菌丝渣；

2)用非水溶性溶剂萃取菌丝渣，得到一次萃取液，所述非水溶性溶剂为醋酸丁酯和/或乙酸乙酯；

3)将一次萃取液依次进行酸洗、浓缩、碱处理，然后用二次萃取溶剂萃取，得到二次萃取液，所述二次萃取溶剂为庚烷、己烷、甲苯和/或二甲苯；

4)对二次萃取液进行酸洗，降温沉淀，过滤取滤液得一次纯化上柱液；

5)用硅胶柱层析分离一次纯化上柱液，收集得一次层析液；

6)用衍生试剂、酸束缚剂对一次层析液中的米尔贝霉素进行衍生处理，所述衍生试剂为对硝基苯甲酰氯、邻硝基苯甲酰氯和/或苯甲酰氯，所述酸束缚剂为吡啶、二乙胺和/或三乙胺；然后用碱洗涤，浓缩，结晶，干燥晶体，再将晶体溶解，过滤取滤液得衍生纯化上柱液；

7)用硅胶柱层析分离衍生纯化上柱液，收集得二次层析液；

8)浓缩二次层析液，结晶，分离，得到米尔贝霉素衍生物晶体；

9)将米尔贝霉素衍生物水解、萃取、浓缩、结晶、干燥得到米尔贝霉素A3和A4含量大于80％的米尔贝霉素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)采用的絮凝剂为聚丙烯酰胺、聚合氯化铝和/或聚合硫酸铁；过滤前加入助滤剂珍珠岩粉和/或硅藻土助滤。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)萃取温度20～50℃，萃取一次或多次，每次时间2～5小时，合并为一次萃取液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)用0.05-0.2mol/L的盐酸或硫酸对一次萃取液进行酸洗；酸洗后真空浓缩蒸尽萃取溶剂，加碱使pH在11～13，搅拌得粘稠料液，然后用二次萃取溶剂进行萃取。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)通过浓缩或稀释二次萃取液，使其米尔贝霉素单位为8000～10000μg/mL，然后采用0.05mol/L的盐酸或硫酸进行酸洗，再降温至8～10℃，静置沉淀8～10小时，过滤分离沉淀，收集滤液得一次纯化上柱液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)和步骤7)中硅胶柱所用硅胶为60～150目的干硅胶，用二次萃取溶剂浸泡后上柱，层析柱的径高比为1:6；所用解析液为二次萃取溶剂∶醋酸丁酯或乙酸乙酯体积比为6:4～7:3的混合溶液；步骤5)收集米尔贝霉素A4的HPLC色谱峰面积比≥30％的解吸液；步骤7)收集米尔贝霉素A4的HPLC色谱峰面积比≥50％的解吸液。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)将一次层析液进行真空浓缩至米尔贝霉素单位为2-4万μg/mL，控制温度28～30℃，加入米尔贝霉素总当量的2～2.5倍当量的衍生试剂和2.5～3倍当量的酸束缚剂，搅拌反应2～4小时，待HPLC色谱检测中米尔贝霉素的峰面积小于1％即终止反应；然后用5％NaHCO₃溶液对反应液进行洗涤；对洗涤后的反应液进行真空浓缩，降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，真空干燥除去有机溶剂；用二次萃取溶剂溶解衍生物结晶，控制溶液浓度1.5～3w/v％，过滤得衍生纯化上柱液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8)将二次层析液进行真空浓缩，得粘稠物，加入二次萃取溶剂，控制温度为50-60℃，米尔贝霉素衍生物单位为8-10万μg/mL，然后降温结晶，控制结晶终点温度5～10℃，分离收集潮晶，于50-60℃真空干燥除去有机溶剂，得米尔贝霉素衍生物晶体。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤9)将干燥的米尔贝霉素衍生物用水溶性有机溶剂溶解，于5～10℃加碱进行水解，水解后用有机溶剂萃取，真空浓缩，降温结晶，分离晶体，干燥得米尔贝霉素。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤9)中，用于溶解米尔贝霉素衍生物的水溶性有机溶剂为二氧六环、四氢呋喃和/或乙醇；水解加入的碱为2～4mol/L的NaOH或KOH溶液；水解后萃取所用有机溶剂为庚烷、甲基环己烷或环己烷；结晶终点温度控制在5～10℃。