[发明专利]包含特异于靶DNA的向导RNA和CAS蛋白质编码核酸或CAS蛋白质的用于切割靶DNA的组合物及其用途有效
申请号: | 201510884156.5 | 申请日: | 2013-10-23 |
公开(公告)号: | CN105441440B | 公开(公告)日: | 2020-12-15 |
发明(设计)人: | 金进秀;曹承于;金素贞;J·M·金;金爽中 | 申请(专利权)人: | 基因工具股份有限公司 |
主分类号: | C12N15/11 | 分类号: | C12N15/11;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/10 |
代理公司: | 北京市中咨律师事务所 11247 | 代理人: | 张莉;黄革生 |
地址: | 韩国*** | 国省代码: | 暂无信息 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 包含 异于 dna 向导 rna cas 蛋白质 编码 核酸 用于 切割 组合 及其 用途 | ||
1.一种在人细胞中在染色体靶核酸序列上引入indel的体外或离体方法,包括:
使人细胞中的所述染色体靶核酸序列与工程化的和/或非天然存在的II型成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas复合物接触,其中该CRISPR/Cas复合物包含:
a)Cas9蛋白,其中该Cas9蛋白包含细胞核定位信号,和
b)包含与反式激活crRNA(tracrRNA)的部分融合的CRISPR RNA(crRNA)的部分的嵌合向导RNA;
其中所述嵌合向导RNA与所述Cas9蛋白形成复合物,
其中,靶核酸序列包含第一链和第二链,第一链具有与嵌合向导RNA的crRNA部分互补的区域,第二链具有三核苷酸原间隔区邻近基序(PAM),
由此,在人细胞中在染色体靶核酸序列处引入indel,
其中所述Cas9蛋白是化脓性链球菌Cas9蛋白,以及
其中所述嵌合向导RNA在crRNA部分的5’末端还包含2个附加的鸟嘌呤核苷酸。
2.根据权利要求1的方法,其中核定位信号位于Cas9蛋白的C末端。
3.根据权利要求1的方法,其中所述Cas9蛋白由编码所述Cas9蛋白的核酸在人细胞中表达,且
其中所述核酸是针对人细胞中表达而进行密码子优化的。
4.根据权利要求1的方法,其中所述染色体靶核酸序列是在人细胞基因组中位于其内源染色体位点处的基因组序列。
5.根据权利要求1的方法,其中在将嵌合向导RNA引入人细胞中之前,体外转录该嵌合向导RNA。
6.根据权利要求1的方法,其中与嵌合向导RNA的crRNA部分互补的区域由20个核苷酸组成,且其中PAM由三核苷酸5’-NGG-3’组成。
7.根据权利要求1的方法,其中所述Cas9蛋白由编码所述Cas9蛋白的核酸在人细胞中表达,且
在将嵌合向导RNA引入人细胞前,将所述核酸引入人细胞。
8.根据权利要求1的方法,其中PAM由三核苷酸5’-NGG-3’组成。
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