[发明专利]包含特异于靶DNA的向导RNA和CAS蛋白质编码核酸或CAS蛋白质的用于切割靶DNA的组合物及其用途有效

专利信息
申请号: 201510884156.5 申请日: 2013-10-23
公开(公告)号: CN105441440B 公开(公告)日: 2020-12-15
发明(设计)人: 金进秀;曹承于;金素贞;J·M·金;金爽中 申请(专利权)人: 基因工具股份有限公司
主分类号: C12N15/11 分类号: C12N15/11;C12N9/22;C12N15/55;C12N15/10
代理公司: 北京市中咨律师事务所 11247 代理人: 张莉;黄革生
地址: 韩国*** 国省代码: 暂无信息
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摘要:
搜索关键词: 包含 异于 dna 向导 rna cas 蛋白质 编码 核酸 用于 切割 组合 及其 用途
【说明书】:

本发明涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地,本发明涉及用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途,所述组合物包含特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。

本申请是申请日为2013年10月23日的、发明名称为“包含特异于靶DNA的向导RNA和CAS蛋白质编码核酸或CAS蛋白质的用于切割靶DNA的组合物及其用途”的中国专利申请201380066348.4(PCT/KR2013/009488)的分案申请。

技术领域

本发明涉及真核细胞或生物体中的靶向基因组编辑。更具体地说,本发明涉及一种用于在真核细胞或生物体中切割靶DNA的组合物及其用途,所述组合物包括特异于靶DNA的向导RNA和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质。

背景技术

CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)是含有多个短同向重复的基因座,其被发现存在于约40%测序细菌的基因组中和90%测序古细菌的基因组中。CRISPR作为原核的免疫系统发挥功能,其赋予对外来遗传元件例如质粒和噬菌体的抵抗性。CRISPR系统提供了一种获得性免疫形式。外源DNA的短片段(称为间隔区)整合在CRISPR重复序列之间的基因组中,作为过去暴露的记忆。然后CRISPR间隔区以类似于真核生物中RNAi的方式用于识别和沉默外来遗传元件。

Cas9,II型CRISPR/Cas系统中一种重要的蛋白质成分,当与称为CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的两个RNA复合时,形成活性核酸内切酶,从而切断入侵噬菌体或质粒中的外源遗传元件,以保护宿主细胞。crRNA从宿主基因组中的CRISPR元件转录,其中该CRISPR元件之前自外源入侵物捕获。最近,Jinek等(1)证明,通过融合crRNA和tracrRNA的必要部分产生的单链嵌合RNA可以取代Cas9/RNA复合体中的两个RNA以形成功能性核酸内切酶。

CRISPR/Cas系统相对于锌指和转录激活因子样效应物DNA结合蛋白提供了优势——因为在核苷酸结合CRISPR-Cas蛋白中的位点特异性由RNA分子调控而不是DNA结合蛋白调控(这在设计和合成上是更具挑战性的)。

然而,到现在为止,尚未开发出使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)的基因组编辑方法。

同时,限制性片段长度多态性(RFLP)是最古老,最方便,和最便宜的基因分型方法之一,其仍然广泛应用于分子生物学和遗传学,但其往往受限于缺乏适当的限制性内切酶识别位点。

可以通过各种方法检测由工程化核酸酶诱导的突变,其中包括错配敏感的T7核酸内切酶I(T7E1)或Surveyor核酸酶测定法,RFLP,荧光PCR产物的毛细管电泳,双脱氧测序和深度测序。T7E1和Surveyor测定法广泛使用,但很繁琐。此外,这些酶倾向于低估突变频率,这是因为突变序列可彼此形成同源双链,从而不能从野生型细胞中区分纯合双等位基因突变体克隆。RFLP没有这些限制,因而是首选的方法。实际上,RFLP是检测细胞和动物中由工程化核酸酶介导的突变的最早方法之一。然而,不幸的是,RFLP受限于适当限制性位点的可得性。在所关注的靶位点有可能没有限制性位点。

发明内容

技术问题

到现在为止,尚未开发使用基于CRISPR/Cas系统的RNA向导核酸内切酶(RGEN)进行基因组编辑和基因分型的方法。

在这种情况下,本发明人进行了大量努力来开发基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑方法,最终建立了一个可程序化的RNA向导核酸内切酶,该RNA向导核酸内切酶可以在真核细胞和生物体中以靶向方式切割DNA。

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