[发明专利]检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种检测非综合症型耳聋基因多态性的引物，其特征在于，包括如下引物：

扩增GJB2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；

扩增GJB3基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示；

扩增SLC26A4-1基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：6所示；

扩增SLC26A4-2基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：7所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：8所示；

扩增12SrRNA基因的引物对：其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：9所示，其下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO：10所示；

其中，SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：10的5′端进行生物素标记；

GJB235DELG测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：11所示；

GJB2176-191DEL16测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：12所示；

GJB2235DELC测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：13所示；

GJB2299-300DELAT测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：14所示；

GJB3538C>T/547G>A测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：15所示；

SLC26A42168A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示；

SLC26A4IVS7A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：17所示；

12SrRNA1494C>T测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：18所示；

12SrRNA1555A>G测序引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：19所示。

2.权利要求1所述的检测非综合症型耳聋基因多态性的引物在制备检测非综合症型耳聋基因多态性试剂中的应用。

3.一种检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括如下试剂：

(1)DNA提取试剂；

(2)PCR反应液：PCR缓冲液，MgCl₂25mmol/L，dNTPs10mmol/L，TaqDNA聚合酶5U/μL，甘油，SEQIDNO：1～10所示的引物10μmol/L；

(3)单链纯化试剂：体积分数为75％乙醇水溶液，0.2mol/LNaOH，10mmol/LpH7.6Tris-Acetate水溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物APS，荧光素，dNTPs，测序引物SEQIDNO：11～1910μmol/L。

4.权利要求3所述的检测非综合症型耳聋基因多态性的试剂盒在检测非综合症型耳聋基因多态性中的应用。

5.一种利用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)提取标本组织中的基因组DNA；

(2)以步骤(1)中所得基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，PCR扩增得到基因片段；

(3)将步骤(2)得到的基因片段与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；

(5)测序结果分析。

6.根据权利要求5所述的用焦磷酸测序技术检测非综合症型耳聋基因多态性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的PCR扩增体系为：

PCR扩增采用50μl体系，其中基因组DNA模板2μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl₂4μL，dNTP3μL，上下游引物各取0.15μL，Taq酶0.3μL，甘油2.5μL，加水补充至50μL；

PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。