[发明专利]一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD‑4，它是将来源于S.albulus PD‑1基因组上的铵转运蛋白基因amtB进行过量表达，具有比白色链霉菌S.albulus PD‑1更高的聚赖氨酸(ε‑poly‑L‑lysine,ε‑PL)合成能力。所述的铵转运蛋白基因序列如SEQ ID No:1所示。本发明还公开了上述重组菌的构建方法与发酵验证。其利用amtB的高效表达，消除因铵载体不足带来的限制，提高S.albulus PD‑4对发酵液中氮源的利用率，从而提高ε‑PL的产量，降低生产成本，带来巨大的经济利益。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株聚赖氨酸发酵菌株及该菌株的构建方法与应用。

背景技术

ε-PL是日本的S.Shima和H.Sakai两位博士1977年在大量筛选生物碱物质时首次发现的一种新型聚氨基，ε-PL是由L-赖氨酸的α-羧基和ε-氨基之间形成的酰胺键聚合而成的聚阳离子，作为天然型的聚氨基酸，ε-PL具有优良的生物相容性和生物降解性，其分子侧链含有大量的亲水性游离氨基，便于对其进行功能化改造，因而ε-PL在保健食品、基因载体、药物缓释、生物医学材料等领域具有广阔的开发和应用前景。生物法合成聚赖氨酸以可再生资源为原料，具有反应条件温和、污染少以及成本低廉等优点，因此，生物合成法是目前ε-PL工业化生产比较经济有效的方法。

ε-PL属于次级代谢产物，在聚赖氨酸的代谢过程中，发酵周期一般需要6-8天，发酵产物ε-PL是一种含氮量较高的化合物，聚合物单体上含有两个氨基，其合成与菌体细胞内的氮素代谢有密切联系，发酵液中的氮素被细胞摄取分解为氨、铵离子(NH₄⁺)或谷氨酸作为合成产物的重要原料，我们猜想提高氮素的供给有可能提高细胞内氮源的供给，从而提高ε-PL合成。

随着分子生物学的发展，利用分子克隆和外源表达及基因过量表达技术可以大幅度地提高目的酶在宿主微生物中的表达量。铵转运蛋白是一类存在于细胞膜上主动转运NH₄⁺的载体，普遍存在于真核生物或原核生物细胞膜上，可将细胞所处环境中的铵离子转运到细胞内，确保微生物氮代谢的正常运行。铵离子转运蛋白的研究主要集中在大肠杆菌、酵母中，但在放线菌中的相关报道却很少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一株小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述小白链霉菌聚赖氨酸发酵基因工程菌株在产聚赖氨酸中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株小白链霉菌基因工程菌，其特征在于，它是将铵转运蛋白基因在Streptomyces albulus PD-1中过量表达铵转运蛋白基因，所述的铵转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。

所述的Streptomyces albulus PD-1为CCTCC NO:M2011043，其分类命名为其分类命名为链霉菌(Streptomyces albulus)，菌株号PD-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2011043，保藏日期：2011年2月21日，地址：武汉大学，邮编430072。该菌株的详细信息已经在申请号为201110049986.8的中国专利中公开。

上述小白链霉菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以S.albulus PD-1的基因组DNA作为模板，以SEQ ID No:2和SEQ ID No:3所示核苷酸序列为引物，PCR扩增得到铵转运蛋白amtB的核苷酸序列，将该核苷酸序列与pIB139质粒连接，得到重组质粒pIB139-amtB；