[发明专利]一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用

说明书

一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用，引物序列如Fon‑1；Fon‑2；SIX1‑F；SIX1‑R；SIX6‑F1；SIX6‑R1所示。本发明适用于植物组织和土壤样品中西瓜枯萎病生理小种的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中西瓜枯萎生理小种引起的病害防治具有重要的实用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用。

背景技术

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的维管束系统病害。病菌通过土壤、种子传播，在离开寄主的情况下，能存活5-6年，厚垣孢子可存活10年以上。它的发生极为普遍，对西瓜产量和品质构成了严重的威胁，是国内外西瓜生产上最严重的病害之一，已成为制约西瓜生产的主要障碍。培育优质抗病西瓜新品种是有效控制西瓜枯萎病的主要方法，但由于西瓜遗传基础狭窄，可供选育的抗病品种抗源单一，效率不高，加之尖孢镰刀菌西瓜专化型的有生理小种分化，致病性变异较大，极难防治。必须针对不同生理小种筛选合适的抗病品种。准确、快速地鉴定西瓜枯萎病菌生理小种，对于一个地区西瓜枯萎病综合防治和筛选合适有效的抗源具有重要意义。

国际上公认的西瓜枯萎病菌有4个生理小种，即生理小种0号、1号、2号和3号，其中2号生理小种的侵染性最强。生理小种3于2010年在美国鉴定分离，但在中国尚未见报道证实。由于尖孢镰刀菌不能通过形态区分专化型，传统上对西瓜枯萎病菌生理小种鉴定主要是采用接种鉴别寄主，根据寄主抗、感病反应结果鉴定小种，接种鉴定方法费时费力，容易受气候、经验等因素影响，准确率低，鉴别效果不稳定。所以急需开发快速准确的分子鉴定方法。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对我国现有的西瓜枯萎病病原，尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.niveum race 0，race1，race1)，提供一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物及其应用。本发明适用于植物组织和土壤样品中西瓜枯萎病生理小种的快速可靠检测和鉴定，对于农业生产中西瓜枯萎生理小种引起的病害防治具有重要的实用价值。

技术方案：一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的引物，引物序列如下所示：

尖孢镰刀菌西瓜专化型特异性引物序列为：

Fon-1：5′CGATTAGCGAAGACATTCACAAGACT 3′；

Fon-2：5′ACGGTCAAGAAGATGCAGGGTAAAGGT 3′；

Six1蛋白编码基因特异性引物序列为：

SIX1-F：5′GTATCCCTCCGGATTTTGAGC 3′；

SIX1-R：5′AATAGAGCCTGCAAAGCATG 3′；

Six6蛋白编码基因特异性引物序列为：

SIX6-F1：5′CTCTCCTGAACCATCAACTT 3′；

SIX6-R1：5′CAAGACCAGGTGTAGGCATT3′。

一种鉴定尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的试剂盒，该试剂盒含有上述三对引物。

所述试剂盒检测尖孢镰刀菌西瓜专化型生理小种的方法，包括以下步骤：

(1)提取尖孢镰刀菌西瓜专化型0号、1号和2号生理小种菌株DNA；采用商用DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini kit,Qiagen,Valencia,CA,USA)提取病菌菌丝DNA，加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀DNA(含20μg/mL RNase)，-20℃保存备用。