[发明专利]一种SNP分型方法及试剂盒

权利要求书

1.一种SNP分型方法，其特征在于，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：

A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；

B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；

C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；

D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

2.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：

C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；

C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；

C3、变性去除连接产物。

3.根据权利要求1所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

4.根据权利要求4所述的SNP分型方法，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列；所述步骤A包括以下步骤:

A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；

A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。

5.根据权利要求3所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤B包括以下步骤：

B1、将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与固定在微球上的接头连接，得固定在微球上的待测序文库分子；

B2、将微球可寻址的固定在固相载体上。

6.根据权利要求5所述的SNP分型方法，其特征在于，所述步骤B1中的连接反应是在切割-连接反应体系中进行的，所述切割-连接反应体系包括：连接酶、断裂剂、固定在微球上的第一接头和连接缓冲液；

所述断裂剂，用于对核酸片段中的可断裂位点或可切除序列进行特异性切割，形成第一粘性末端；

所述第一接头为核酸分子，含有与第一粘性末端完全互补配对的第二粘性末端。

7.根据权利要求6所述的SNP分型方法，其特征在于，步骤B1中所述连接缓冲液中含有5-10% PEG。

8.一种SNP分型试剂盒，其特征在于，包括CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对、CYP2C19特异性引物对、无荧光标记的寡核苷酸探针。

9.根据权利要求8所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

10.根据权利要求9所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

11.根据权利要求8所述的SNP分型试剂盒，其特征在于，还包括建库连接缓冲液，所述建库连接缓冲液中含有5-10% PEG。