[发明专利]一种SNP分型方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及DNA检测技术领域，更具体地说，涉及一种SNP分型方法及试剂盒。

背景技术

单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化。目前，国内外常见的SNP分型检测技术包括以下几种，高分辨率融解曲线检测法（high resolution melting，HRM）、基于芯片技术的SNP分型方法、等位基因特异性扩增法（Amplification Refractory Mutation System Real Time PCR，ARMS-RT PCR）、Taqman荧光探针法、质谱法、高效液相层析法和基因测序法等。

其中，基因测序法又包括以Sanger技术为基础的第一代测序技术，和具有高通量、低成本特点的第二代高通量测序技术。第二代高通量测序技术包括连接测序法和合成测序法。其中，所述连接测序法是基于连接酶在核酸片段之间进行连接反应的过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物（又称测序引物，其与待测序核酸片段所在链互补）和寡核苷酸探针（该探针的特定位置上带有荧光标记）进行连接反应，通过检测连接产物上的荧光标记从而确定寡核苷酸探针上带有荧光标记的特定位置对应的序列的信息。所述合成测序法是基于聚合酶在延伸核酸链过程中的保真性来实现的，以待测序核酸片段为模板，锚定引物互补结合至待测序核酸片段上，通过检测在延伸过程中产生的信号来确定待测序核酸片段上相应位置的序列信息。

在CN201410168995.2中，披露了一种基于连接测序技术的SNP分型方法，本申请发明人在利用该技术对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点进行检测时发现，所得测序结果中存在一定比例的错误信号，而这些错误信号将会干扰测序结果的分析，降低SNP位点检测的准确性。

因此需要一种新的SNP分型方法和试剂盒，以提高对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点检测准确率更高的SNP分型方法和试剂盒，旨在解决现有技术中测序结果中存在较高比例的错误信号的技术问题。

为了实现发明目的，一种SNP分型方法，待测SNP位点包括CYP2C9、VKORC1和CYP2C19基因中的SNP位点，所述SNP分型方法包括以下步骤：

A、含待测SNP位点核酸片段的获得：利用CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物；

B、待测序文库分子的构建：将CYP2C9扩增产物、VKORC1扩增产物和CYP2C19扩增产物分别与接头连接，形成相应的待测序文库分子，并将待测序文库分子通过微球可寻址的固定在固相载体上；

C、封闭非特异性结合位点：利用无荧光标记的寡核苷酸探针替换有荧光标记的寡核苷酸探针，对固定在固相载体上的待测序文库分子进行一次连接测序反应；

D、连接测序获得待测SNP位点的序列信息。

其中，所述步骤C包括以下步骤：

C1、将锚定引物锚定在待测序文库分子上；

C2、加入无荧光标记的寡核苷酸探针、连接酶以及相应的缓冲液，进行连接反应；

C3、变性去除连接产物。

其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

其中，所述CYP2C9特异性引物对、VKORC1特异性引物对和CYP2C19特异性引物对均包括外引物对和内引物对；所述CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对中均至少有一种PCR引物上含有可断裂位点或可切除序列。

其中，所述步骤A包括以下步骤:

A1、利用CYP2C9、VKORC1和CYP2C19外引物对分别对待测样本进行PCR扩增，得CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物；

A2、分别以CYP2C9第一次扩增产物、VKORC1第一次扩增产物和CYP2C19第一次扩增产物为模板，利用相应的CYP2C9、VKORC1和CYP2C19内引物对分别进行PCR扩增，得CYP2C9第二次扩增产物、VKORC1第二次扩增产物和CYP2C19第二次扩增产物。