[发明专利]一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母(Candidaglabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外，C.glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程中，随着产物的积累，培养基pH迅速降低，导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近年来国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌体的酸耐受性和有机酸产量。对C.glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问题，但此机制尚不清楚。因此，进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要，这对提高有机酸产量具有指导意义。

目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展，蛋白质组学分析发现相对于高pH来说，光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发现光滑球拟酵母可通过CgYps1调节质子泵CgPma1的活性以适应酸胁迫环境。此外，研究者们对光滑球拟酵母转录因子进行的功能鉴定发现，Msn2p和Msn4p是抵御多种环境压力必不可少的转录因子，Yap1p、Skn7p和Slm7p通过抵御氧胁迫参与酸胁迫应答反应。

对光滑球拟酵母酸胁迫的耐受机制研究处于初步阶段，仍没有形成系统的转录调控网络，因此，从转录因子着手进行相关研究具有重要的意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明鉴定了一种调控光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子Crz1p的功能，发现光滑球拟酵母缺失CgCRZ1基因后，与野生型菌株相比，不能正常表达转录因子CgCrz1p，生长能力降低，且在酸胁迫条件下的细胞膜性能改变，胞内微环境发生变化，菌株的酸胁迫耐受性降低。

本发明提供一种改变光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，是缺失突变CgCRZ1基因以降低菌株酸胁迫抗性，或者过表达CgCRZ1基因以提高菌株的酸胁迫抗性。

所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母是CandidaglabrataATCC55。

在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因HIS3同基因CgCRZ1左臂和右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确敲除框电击转化到光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgCRZ1替换成标记基因HIS3，利用重组后的菌株含有基因CgHIS3而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgCRZ1基因的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的突变菌株即为缺失突变CgCRZ1基因的菌株Cgcrz1Δ。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将扩增CgCRZ1基因序列并克隆到质粒pY26上，由强启动子GPD1启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将CgCRZ1基因克隆到质粒pY26并在基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中过表达，利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株，验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1。

本发明还提供一种酸胁迫抗性降低的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母缺失了CgCRZ1基因；所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

本发明还提供一种酸胁迫抗性提高的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母过表达CgCRZ1基因；所述CgCRZ1基因的核苷酸序列是NCBI上geneID:2891693的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是：扩增CgCRZ1基因序列，通过T4连接酶将CgCRZ1基因经酶切位点BamHI和StuI克隆到高拷贝质粒pY26上，由强启动子GPD1启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZ1电击转化到光滑球拟酵母基因缺失突变菌株Cgcrz1Δ中，利用质粒pY26上的尿嘧啶基因URA3作为标记筛选基因回补菌株，将经过质粒PCR和质粒酶切验证正确的菌株命名为Cgcrz1Δ/CgCRZ1，编号保存。

本发明还要求保护所述光滑球拟酵母在生产有机酸方面的应用，以及在食品、化工、制备药物方面的应用。

本发明还提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜组成的方法，所述方法是过表达CgCRZ1基因。

本发明的有益效果：