[发明专利]重组Ad-TNFR2 shRNA腺病毒及其构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，涉及一种腺病毒的构建，特别是涉及一种干扰TNFR2表达的重组腺病毒。

背景技术

NMDA受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸受体，属离子型受体，在突触可塑性及兴奋毒性方面具有重要作用。

NMDA受体是由NR1、NR2和NR3亚单位组成的异四聚体，每种亚基在中枢神经系统中的分布不尽相同。一般认为，NR1是NMDA受体的必需亚基，在大脑和脊髓中大量分布，是实现其通道功能所必需的。NMDA受体不仅在神经系统发育过程中发挥重要的生理作用，而且对神经元回路的形成亦起着关键作用。Bird等人发现，在关节炎模型的大鼠杏仁核神经元中，NMDA受体NR1的磷酸化(pNR1)明显上调，而NR1的表达没有明显变化；脑片膜片钳实验中，给予杏仁核神经元NMDA受体的拮抗剂AP5可显著降低NMDA受体介导的EPSC幅度，而且在抑制PKA，即阻断了PKA磷酸化NR1的途径后，NMDA受体介导的EPSC也被阻断，类似现象在抑制PKC后并没有出现。这说明PKA介导的NR1磷酸化在突触后膜表达上调，是导致突触传递发生可塑性变化的重要原因，也是发生痛觉过敏的基础。

肿瘤坏死因子(TNF-α)是由神经元和胶质细胞分泌的炎性因子，TNF-α的许多生物效应是通过两个细胞表面受体TNFR1和TNFR2介导的。TNF-α的大多生物活性由TNFR1来传递信号，如细胞程序性死亡、抗病毒活性、转录因子NF-kappaB的激活以及宿主防御等；通过TNFR2的信号通路仅局限于免疫系统。这两个受体是TNF受体超家族的成员。

疼痛发生时，不仅神经元产生的神经肽类物质参与了痛信号的传入，而且神经胶质细胞释放的多种促炎细胞因子，如IL-1β和TNF-α等也促进伤害性信息的传入，如在炎性痛模型鼠脊髓就会明显发生TNF-α的表达上调。

资料表明，中枢和外周因素引起脊髓TNF-α表达上调，可以促成炎性和神经性疼痛的发生；脊髓胶质细胞释放的TNF-α可以提高神经元的兴奋性；癌痛动物内源性的TNF-α表达上调增强热敏反应；在鞘内直接注射TNF-α可增强大鼠脊髓广动力神经元的反应，并快速诱发动物自发性缩足行为和热痛反应，而在鞘内注射溶解的TNF-α受体的抗体显著减弱大鼠异常疼痛的发生。以上这些都说明，TNF-α在脊髓水平都可以通过激活TNF受体(TNFR)诱发痛觉过敏。

Wei等人研究发现，在脑干RVM利用TNF-α抑制剂，可减弱眶下神经慢性缩窄性损伤(CCI)诱发的痛敏反应，并下调pNR1的表达。因此，可以设想在脊髓水平TNF-α通过激活TNFR，介导了NMDA受体NR1亚基的磷酸化，引起兴奋传递的可塑性变化以及痛敏的发生。新近研究表明，TNF-α可以增加普通小鼠脊髓层细胞NMDA电流，鞘内应用NMDA受体阻断剂MK-801后可减弱鞘内注射TNF-α所致的热痛反应，说明TNF-α通过其受体TNFR影响了NMDA受体的功能活动。

目前已知TNFR的2种亚型TNFR1(55KD)和TNFR2(75KD)在背根神经节(DRG)和脊髓都有表达，但二者在痛调制中的作用还有争议。一般认为TNFR1与痛信号传递、痛觉过敏发生有密切关系，TNFR2并不参与此过程。而新近研究提出了不同的观点，Schafers等通过体内和体外实验证实，神经损伤后TNFR1在引起感觉神经元兴奋及诱导痛反应的过程中起主要作用，TNFR2在TNFR1作用时发挥协同作用，它独自并不产生类似TNFR1的作用，但在神经受损后，对临近未损伤感觉神经元的兴奋有易化作用。Xu等人认为，在L5腹前根离断损伤模型引起的神经病理性疼痛中，背根神经节和脊髓后角的TNF-α及其受体TNFR1的上调主要在疼痛起始过程起作用，但与神经切断产生的持续性疼痛无关。另外敲除TNFR1和TNFR2基因的小鼠实验提示，TNFR1和TNFR2都参与炎性痛和痛敏的过程，但TNFR1发挥了主导作用，TNFR2是参与了早期阶段的炎性痛反应。

TNF-α在痛信号传入时表达增多，并参与痛敏及异常疼痛的发生和维持，但其通过何种方式介导了这一过程，脊髓TNFR被激活后通过何种途径引起痛觉过敏，目前还并不清楚。鉴于以上研究，需要对炎性痛敏发生时，TNFR1和TNFR2与痛敏及pNR1的相互关系做进一步的研究。上述研究的基础是需要构建一种干扰TNFR基因表达的质粒载体，以用于阻断TNF与TNFR结合，阻断TNF通过该途径产生生物学效应。

发明内容