[发明专利]一种体外肝间质细胞的分离方法在审
| 申请号： | 201510899041.3 | 申请日： | 2015-12-09 |
| 公开（公告）号： | CN105420181A | 公开（公告）日： | 2016-03-23 |
| 发明（设计）人： | 刘思德;庄康敏;罗晓蓓;李爱民;余严军;张菊嫦;孟琰 | 申请（专利权）人： | 南方医科大学南方医院 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 广州知友专利商标代理有限公司 44104 | 代理人： | 宣国华 |
| 地址： | 510515 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 体外 间质 细胞 分离 方法 | ||
1.一种体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）采用多点穿刺灌流法，在正常肝组织表面进行多点穿刺，将前灌流液及消化液依次灌注入正常肝组织标本中；
（2）步骤（1）处理后所得的肝组织标本经过充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞后，得到原代肝间质细胞；
（3）将步骤（2）培养得到的肝间质细胞进行扩增传代，获得肝间质细胞群；
所述的步骤（3）中所述的充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞包括以下具体步骤：
充分消化：将步骤（2）所得的充分灌注后的肝组织切碎后，在37℃摇床中以30~50rpm/s的转速摇晃20~30min；用于充分消化肝组织碎片间的胶原纤维，以释放出肝脏间间充质细胞；
初步过滤：将充分消化步骤后所得的液体经100目过滤网过滤，收集滤液，并将所得的滤液50g离心5min；用于充分过滤掉未能充分消化掉的肝组织碎片；
重悬再过滤：收集初步过滤步骤中离心后所得的沉淀，并将其重悬；使用200目滤网过滤；50g离心5min；用于去除第一次离心后可能剩余的纤维组织，保证细所得到的胞的纯度；
获得间间充质细胞：取离心后的上清液，50g离心5min，取沉淀。
2.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的前灌流液由以下组分组成：8g/LNaCl、0.4g/LKCl、0.12g/LNa2HPO4·12H2O、0.06g/LKH2PO4、0.35g/LNaHCO3、1.0g/L葡萄糖,、2.38g/L浓度为10mmol/L的HEPES溶液、0.74g/L浓度为2.5mmol/L的EDTA溶液。
3.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的消化液为含有0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基。
4.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的前灌流液在配制完成后首先经高压灭菌消毒处理，然后进行过滤除菌；所述的消化液在配制完成后进行过滤除菌。
5.根据权利要求4所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的过滤除菌包括使用0.22μm过滤器进行过滤。
6.根据权利要求1所述的体外肝间质细胞的分离方法，其特征在于：所述的正常肝组织样本为肝脏切除术后所得的肝组织标本，大小为1.5~2cm3。
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