[发明专利]一种体外肝间质细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞分离方法，尤其涉及一种体外肝间质细胞的分离方法。

背景技术

生物人工肝是一种借助体外的机械、化学或生物反应装置，维持肝脏功能的支持系统；其可通过暂时辅助或部分代替严重病变的肝脏功能，维持肝衰竭患者生命，具有广阔的发展前景。目前，生物人工肝的研究重点主要集中在反应器及细胞材料的构建上，其中细胞材料作为人工肝系统不可或缺的“种子”，一直受到广泛的研究和关注。

区别于其它已经建立的肿瘤源性人工肝细胞株，间质干细胞是一种可塑性强、具有定向分化能力，且不易发生致瘤隐患的细胞。目前，已有学者研究探讨了其定向分化为类肝样细胞的能力，如Za.goura等在妊娠中期的羊水中提取出间质干细胞(AF-MSCs)，体外利用肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(bFGF)诱导分化成肝祖细胞样细胞(HPL)和肝细胞样细胞(HL)，植入由CCl4诱导的急性肝衰竭小鼠，发现能够明显改善其肝功能。

肝脏间质干细胞作为一种新近发现的细胞群，已有研究表明其能够定向分化为类肝样细胞，且具有较好的肝脏代谢及排毒功能。而且，肝间质细胞的安全性亦得到了认可，为生物人工肝提供了新型的细胞材料来源。然而，如何分离并获得大规模肝间质细胞是首先需要解决的问题。目前，肝脏间质细胞的分离及获取均未有统一，规范的方法学探讨，亦未有报道过大规模获取肝间质细胞群的研究技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种体外肝间质细胞的分离方法，该方法能够快速获得大量高纯度且具有增殖分化能力的肝间质细胞。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种体外肝间质细胞的分离方法，包括以下步骤：

（1）采用多点穿刺灌流法，在正常肝组织表面进行多点穿刺，将前灌流液及消化液依次灌注入正常肝组织标本中；

（2）步骤（1）处理后所得的肝组织标本经过充分消化、初步过滤、重悬再过滤、取得间充质细胞后，得到原代肝间质细胞；

（3）将步骤（2）培养得到的肝间质细胞进行扩增传代，获得肝间质细胞群；

所述的步骤（3）中所述的充分消化、初步过滤、重悬再过滤和取得间充质细胞包括以下具体步骤：

充分消化：将步骤（2）所得的充分灌注后的肝组织切碎后，在37℃摇床中以30~50rpm/s的转速摇晃20~30min；本步骤的目的在于充分消化肝组织碎片间的胶原纤维，以释放出肝脏间间充质细胞；37℃是为了保证胶原酶消化的最适温度，在50rpm/s下摇晃30min是为了保证充分消化；

初步过滤：将充分消化步骤后所得的液体经100目过滤网过滤，收集滤液，并将所得的滤液50g离心5min；本步骤的目的在于充分过滤掉未能充分消化掉的肝组织碎片；

重悬再过滤：收集初步过滤步骤中离心后所得的沉淀，并将其重悬；使用200目滤网过滤；50g离心5min；本步骤的目的在于去除第一次离心后可能剩余的纤维组织，保证细所得到的胞的纯度；

取得间充质细胞：取离心后的上清液，50g离心5min，取沉淀。离心后的上清液富含肝脏间充质细胞，故将其进一步离心后得到沉淀即为高纯度的间充质细胞。

优选地，所述的正常肝组织样本为肝脏切除术后所得的肝组织标本，大小为1.5~2cm³。

优选地，所述的前灌流液由以下组分组成：8g/LNaCl、0.4g/LKCl、0.12g/LNa₂HPO₄·12H₂O、0.06g/LKH₂PO₄、0.35g/LNaHCO₃、1.0g/L葡萄糖,、2.38g/L浓度为10mmol/L的HEPES溶液、0.74g/L浓度为2.5mmol/L的EDTA溶液。

优选地，所述的消化液为含有0.05%IV型胶原酶的DMEM培养基。

优选地，所述的前灌流液在配制完成后首先经高压灭菌消毒处理，然后进行过滤除菌；所述的消化液在配制完成后进行过滤除菌。

更优选地，所述的过滤除菌步骤使用0.22μm过滤器进行过滤。

与现有技术比，本发明的技术优点在于：