[发明专利]一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用

权利要求书

1.一种嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌，其特征在于：该工程菌的保藏编号为CGMCCNo.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。

3.权利要求2所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其步骤如下：

(1)以Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725全基因组DNA为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨酸标签基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因；

(2)将步骤(1)得到的嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC酶切后与pET20b(+)表达载体连接，得到重组表达载体pET20b(+)-PelC；

(3)将重组表达载体pET20b(+)-pelC转化到大肠杆菌表达宿主Escherichia coliBL21(DE3)中，构建得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。

4.如权利要求3所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤(1)中所述的引物包括上游引物和下游引物，

上游引物5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC 3'，

下游引物5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG 3'，

上游引物5'端CATATG为NdeⅠ酶切位点，保护碱基GGAATTC；下游引物5'端CTCGAG为XholⅠ酶切位点，保护碱基CCG。

5.一种嗜热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求5所述的嗜热碱性果胶裂解酶的制备方法，其特征在于：是将权利要求2所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌接种至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，接种量2‰～5‰(v/v)，37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝6.0，获得种子液；然后将种子液接种至含有50μg/mL氨苄的装有2L发酵培养基的5L锥形瓶中，接菌量为2‰～5‰(v/v)，于37℃、170r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时加入终浓度0.5mM IPTG进行诱导，同时将温度调整为25～28℃，转速调整为100～120r/min，诱导发酵18～24h，从而得到工程菌发酵液；再将细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，通过镍柱亲和层析法得到嗜热碱性果胶裂解酶。

7.权利要求5所述嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用。

8.如权利要求7所述嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用，其特征在于：果胶物质为多聚半乳糖醛酸。